肖 瑤，蔣經(jīng)偉，李石磊，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

酚氧化酶(PO)作為無脊椎動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的免疫組分之一，其自身通常不具有殺菌或抑菌活性，但可以催化酚類底物生成醌類，醌類再經(jīng)過一系列的非酶促反應(yīng)最終生成黑色素[1]。醌類物質(zhì)被報(bào)道具有殺菌和抑菌等作用，而黑色素也被發(fā)現(xiàn)具有凝集病原菌、修復(fù)損傷和介導(dǎo)吞噬等作用[2]。

酚氧化酶免疫功能的發(fā)揮與其自身的生化和酶學(xué)特性密切相關(guān)[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，用純化后的酚氧化酶進(jìn)行的生化及酶學(xué)特性研究，對(duì)了解酚氧化酶的免疫特性具有重要意義，酚氧化酶的分離純化及生化特性研究在昆蟲和甲殼類動(dòng)物中已有廣泛報(bào)道[4]，在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，除血淋巴外，其他組織在常態(tài)下酚氧化酶不表達(dá)，而在應(yīng)激狀態(tài)下可迅速啟動(dòng)潛在的酚氧化酶表達(dá)和釋放能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫和抵抗水平[5]。因此，了解酚氧化酶的生化和酶學(xué)特性對(duì)解析酚氧化酶的免疫功能具有重要意義。目前在悉尼巖牡蠣(Saccostreaglomerata)[2]、光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)[6]、阿根廷滑柔魚(Illexargentinus)[7]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[8]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[9]等海洋無脊椎動(dòng)物中，相繼開展了酚氧化酶的生化與酶學(xué)特性分析。在光棘球海膽和櫛孔扇貝中，各發(fā)現(xiàn)了3種酚氧化酶，在悉尼巖牡蠣中發(fā)現(xiàn)了2種酚氧化酶[2,6-9]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是棘皮動(dòng)物門的典型代表生物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國海水增養(yǎng)殖的重要品種之一[5,10]。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害時(shí)有發(fā)生[11]。研究仿刺參的免疫和生理特性，對(duì)其病害防控具有重要意義。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參幼參體腔液中含有3種酚氧化酶[12]，分別為AjPO1、AjPO2和AjPO3。這3種酚氧化酶的分子質(zhì)量均小于21 ku，具有不同的生理、生化特性，并且承擔(dān)不同的免疫功能。之后在仿刺參成參的體腔上清液和體腔細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了與幼參相同的AjPO2和AjPO3，同時(shí)在成參體腔細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了3種新酚氧化酶，這3種酚氧化酶在仿刺參雌、雄個(gè)體間的分布存在差異，其中雌性個(gè)體的體腔細(xì)胞中3種酚氧化酶同時(shí)存在，而雄性個(gè)體的體腔細(xì)胞中僅有2種酚氧化酶存在[13]。目前仿刺參成參體腔細(xì)胞中酚氧化酶系統(tǒng)的具體生化特性和功能的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

筆者自仿刺參成參體腔細(xì)胞中分離純化出4種酚氧化酶，對(duì)4種酚氧化酶的耐熱性、最適pH、底物特異性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、二價(jià)金屬離子和抑制劑對(duì)酶活性的影響方面進(jìn)行研究，為進(jìn)一步查明仿刺參成參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能機(jī)制、探索酚氧化酶系統(tǒng)在仿刺參中的免疫和生理功能提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量(236±5) g仿刺參雌、雄各30頭，在仿刺參產(chǎn)卵時(shí)，根據(jù)排精排卵來判斷雌雄，并將雌、雄仿刺參分別于試驗(yàn)室暫養(yǎng)(水溫15～18 ℃，pH 8.1～8.3，鹽度31)7 d。樣品均取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院海水養(yǎng)殖引育種中心。

1.2 體腔細(xì)胞破碎液的制備

用剪刀分別將雌、雄仿刺參從腹部劃開，收集仿刺參體腔液，分別進(jìn)行離心(4 ℃，6000 r/min，10 min)，棄上清液，將雌、雄仿刺參的體腔細(xì)胞分別充分混勻后，加入磷酸緩沖液，經(jīng)超聲波破碎后再次進(jìn)行離心(4 ℃，14 000 r/min，25 min)，取體腔細(xì)胞破碎上清液，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 仿刺參酚氧化酶的分離純化

采用鄰苯二酚發(fā)色法結(jié)合線性連續(xù)梯度非變性電泳的方法來分離雌、雄仿刺參體腔細(xì)胞破碎液中的酚氧化酶[11]。在含量為6%～18%的線性連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳17 h(4 ℃，恒功率2 W)，使用分子質(zhì)量為480～1236 ku的非變性電泳Marker作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白參考；電泳結(jié)束后，參考文獻(xiàn)[6]分離光棘球海膽酚氧化酶的操作方法進(jìn)行雌、雄仿刺參酚氧化酶的分離純化。將純化后的雌、雄仿刺參的酚氧化酶溶液，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用多巴絡(luò)合物生成法[14]測(cè)定酚氧化酶活性，在490 nm波長下連續(xù)測(cè)定吸光度值(D490)，D490每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活性單位(U)。將時(shí)間和測(cè)得吸光度值的線性規(guī)律繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到公式(1)，將不同條件下的吸光度值分別代入公式(1)即可得到不同條件下的酶活性。

y=kx+b

(1)

式中，x為時(shí)間，y為吸光度值，斜率k的絕對(duì)值即酶活性，b為截距。

1.4 pH和高溫對(duì)酶活性的影響

用濃度15 mmol/L的左旋多巴溶于pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中，通過向1.5 mol/L的Tris溶液中滴加濃鹽酸的方法來調(diào)節(jié)緩沖液的pH，100 μL純化后的酚氧化酶溶液與2.0 mL不同pH的左旋多巴溶液混勻后，采用分光光度法在490 nm波長下測(cè)定吸光度值，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

將4種酚氧化酶分別在沸水中加熱5、10、20、30 min，以20 mmol/L多巴胺為底物與加熱后4種酚氧化酶混合，采用分光光度法在490 nm波長下測(cè)定吸光度值，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

開孔鋼板連接件(perfobond strip connector，也稱為PBL連接件)是1987年，德國學(xué)者Leonhardt在解決委內(nèi)瑞拉的卡羅尼第三大橋組合結(jié)構(gòu)剪力連接件的疲勞問題時(shí)提出的一種新型剪力連接件[2].PBL連接件是通過開孔鋼板在混凝土板中形成的一系列混凝土榫、開孔鋼板和貫穿鋼筋共同承擔(dān)剪力.

1.5 二價(jià)金屬離子對(duì)酶活性的影響

選用Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+、Cd2+、Fe2+、Zn2+進(jìn)行二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活性影響的試驗(yàn)，分別使用CaCl2、MgSO4、CuSO4、MnSO4、Pb(CH3COO)2、CdCl2、FeSO4、ZnSO4作為金屬離子的來源，采用超純水作為空白對(duì)照，參照文獻(xiàn)[6]的方法操作。得到的混合物用分光光度法在490 nm波長下測(cè)定吸光度值，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

1.6 抑制劑對(duì)酶活性的影響

選取抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、二乙基二硫代氨基甲酸鈉作為酚氧化酶的抑制劑，超純水作為空白對(duì)照，并參照文獻(xiàn)[6]的試驗(yàn)方法操作。得到的混合物采用分光光度法，在490 nm波長下測(cè)定吸光度值, 分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

1.7 底物特異性

選用鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚作為不同底物，對(duì)照組用等體積的Tris-HCl緩沖液(pH 7)，參照文獻(xiàn)[6]的試驗(yàn)方法操作，得到的混合物用分光光度法在490 nm波長下測(cè)定吸光度值，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算各組酚氧化酶活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較，獲得不同抑制劑對(duì)酶活性作用的差異性，P<0.05視為顯著抑制，P<0.01視為極顯著抑制，用Origin 7.5軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1 仿刺參酚氧化酶的分離純化

非變性電泳后，經(jīng)鄰苯二酚發(fā)色，共發(fā)現(xiàn)4條酚氧化酶條帶，均呈現(xiàn)褐色(圖1a)。為區(qū)別于仿刺參幼參體內(nèi)的3種酚氧化酶，將這4種酚氧化酶按分子質(zhì)量由高到低分別命名為AjPO4、AjPO5、AjPO6、AjPO7，與右側(cè)(圖1b)Jiang等[13]的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可知AjPO5為本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的新酚氧化酶，這4種酚氧化酶的分子質(zhì)量均大于Marker中標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量為720 ku的條帶，其中分子質(zhì)量越小的條帶遷移速率越快。

圖1 雌雄仿刺參體腔細(xì)胞破碎液非變性電泳圖Fig.1 Native-PAGE of coelomocyte lysate supernatant (CLS) in male and female sea cucumber A. japonicusa:1.非變性電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 2～4.雄性仿刺參電泳條帶； 5～7.雌性仿刺參電泳條帶； b:1.雄性仿刺參電泳條帶； 2.雌性仿刺參電泳條帶[12].a:1.protein marker for native-PAGE; 2—4.CLS stained with catechol in male sea cucumber A.japonicus; 5—7.CLS stained with catechol in female sea cucumber A. japonicus； b:1.CLS stained with catechol in sea cucumber male A. japonicus; 2.CLS stained with catechol in female sea cucumber A. japonicus[12].

2.2 pH和溫度對(duì)酚氧化酶活性的影響

測(cè)定的pH為2.0～10.0，使用多巴胺作為底物，仿刺參中AjPO4和AjPO6在pH為9.0時(shí)具有最高活性，AjPO5和AjPO7在pH為8.0時(shí)具有最高活性；當(dāng)pH高于9.0時(shí)，4種酚氧化酶的活性隨pH的升高而降低(圖2)。

仿刺參酚氧化酶的耐熱性試驗(yàn)顯示，AjPO4、AjPO5、AjPO6在沸水中的時(shí)長對(duì)酶活性基本無太大的影響，耐熱性較好；AjPO7在沸水中的時(shí)長超過20 min時(shí)酶活性急劇下降，耐熱能力較其他3種弱一些(圖3)。

2.3 二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活性的影響

Mn2+和Fe2+對(duì)仿刺參4種酚氧化酶活性均有很強(qiáng)的激活作用，激活程度隨金屬離子濃度的增加而變化。當(dāng)Mn2+濃度超過25 mmol/L時(shí)，AjPO4酶活性開始降低，Ca2+濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)，AjPO4酶活性開始降低并逐漸失活。在Mn2+和Fe2+的作用下，AjPO5酶活性隨著金屬離子濃度的增加而增加，Pb2+、Cu2+、Zn2+對(duì)AjPO5酶活性有小幅度的激活。除了Mn2+和Fe2+外，其他金屬離子對(duì)AjPO6刺激作用并不明顯。在Fe2+的作用下，AjPO7酶活性增強(qiáng)明顯，當(dāng)Fe2+濃度超過25 mmol/L時(shí)，AjPO7的酶活性開始下降，當(dāng)Cd2+濃度超過15 mmol/L時(shí)，該酚氧化酶活性有小幅度增強(qiáng)(圖4)。

圖2 pH對(duì)仿刺參酚氧化酶活性的影響Fig.2 The effects of pH on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

圖3 仿刺參酚氧化酶的耐熱性Fig.3 The effects of temperature on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

2.4 抑制劑對(duì)酚氧化酶活性的影響

在仿刺參中，亞硫酸鈉、抗壞血酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、檸檬酸對(duì)酚氧化酶均有一定的抑制作用，乙二胺四乙酸二鈉對(duì)AjPO6和AjPO7有輕微抑制作用，對(duì)AjPO4、AjPO5無抑制作用。其中AjPO4、AjPO6和AjPO7受檸檬酸抑制最顯著，AjPO7受二乙基二硫代氨基甲酸鈉抑制較明顯(圖5)。亞硫酸鈉對(duì)4種酚氧化酶活性均有一定的抑制作用。

2.5 酚氧化酶的底物特異性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算得出(圖6)，AjPO4對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為0.25、5.76、50.00、33.33 mmol/L；AjPO5對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為4.89、6.61、14.29、8.77 mmol/L；AjPO6對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為1.51、2.65、8.85、14.29 mmol/L；AjPO7對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為1.63、3.95、13.51、83.33 mmol/L。4種酚氧化酶的最適底物均為鄰苯二酚。

圖4 不同金屬離子對(duì)AjPO4、AjPO5、AjPO6和AjPO7的影響Fig.4 The effects of different metal ions on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

圖5 不同抑制劑對(duì)仿刺參酚氧化酶活性的影響Fig.5 The effects of different inhibitors on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus*表示顯著抑制(P<0.05)，**表示極顯著抑制(P<0.01).* represents significant inhibition(P<0.05); ** represents very significant inhibition(P<0.01).

3 討 論

3.1 仿刺參體酚氧化酶的分離純化

已有的研究發(fā)現(xiàn)，在仿刺參成參體腔細(xì)胞內(nèi)存在3種不同于仿刺參幼參的酚氧化酶，其中雌性3種，雄性2種[12-13]。筆者在已有基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了1種新的酚氧化酶，這種酚氧化酶為雌、雄仿刺參共有，分子質(zhì)量為1048～1236 ku，與仿刺參幼參體內(nèi)酚氧化酶不同。發(fā)現(xiàn)的這4種成參特有的酚氧化酶的分子質(zhì)量均在720～1236 ku，分別承擔(dān)不同的生化特性和免疫反應(yīng)特性。為確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，經(jīng)過多次的反復(fù)驗(yàn)證，80%情況下均可得到此酚氧化酶，由于這4種酚氧化酶在常溫下極易失活，所以存在沒有成功分離純化的情況，且這4種酚氧化酶的含量較低，通過非變性電泳的方法分離可能會(huì)出現(xiàn)失敗情況。

3.2 酚氧化酶的底物特異性

這4種酚氧化酶的分子質(zhì)量在其他物種中已發(fā)現(xiàn)的酚氧化酶中屬于分子質(zhì)量較大的。自亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)血淋巴中分離純化出酚氧化酶，該酶在非變性電泳中顯示其分子質(zhì)量為158 ku[14]；在大螯蝦(Panulirusargus)[15]中，采用非變性電泳的方法從血淋巴中分離得到了酚氧化酶，該酶在非變性電泳中顯示分子質(zhì)量為300 ku；在海洋無脊椎動(dòng)物中線性連續(xù)梯度非變性電泳中酚氧化酶的分子質(zhì)量一般大于100 ku[16-17]。但在光棘球海膽的酚氧化酶系統(tǒng)中，酚氧化酶的分子質(zhì)量是遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker的最小值[6]，這說明兩種生物即使在進(jìn)化上相似，但也存在著酚氧化酶分子質(zhì)量差異較大的現(xiàn)象。動(dòng)力學(xué)分析表明，4種酚氧化酶最適底物為鄰苯二酚，米氏常數(shù)Km值分別為0.25、4.89、1.51、1.63。以左旋多巴為底物，仿刺參4種酚氧化酶的最適pH分別為9.0、8.0、9.0、8.0，這意味著，仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)在弱堿性環(huán)境下活性更強(qiáng)。此外，這4種酚氧化酶在pH為5.0～7.0時(shí)活力較低，表明pH偏低的酸性條件對(duì)仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的功能可能產(chǎn)生抑制。

3.3 酚氧化酶的耐熱性

通過分析仿刺參酚氧化酶耐熱性的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AjPO4、AjPO5、AjPO6 3種酚氧化酶在沸水中的時(shí)長對(duì)酶活性無明顯影響，可以看出仿刺參酚氧化酶具有很好的耐熱性，這與大多數(shù)海洋無脊椎動(dòng)物酚氧化酶特征相同；而AjPO7在沸水中超過20 min活性開始急劇下降，AjPO7是雌性仿刺參特有的一種酚氧化酶，其他3種酚氧化酶是雌、雄仿刺參共有。關(guān)于AjPO7與其他3種酚氧化酶的耐熱性差異能否對(duì)雌、雄仿刺參的耐熱性產(chǎn)生影響，還需進(jìn)一步研究。

3.4 二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活性的影響

近年，有關(guān)在某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物人工配合飼料中添加金屬離子的報(bào)道較多。李荷芳等[18]研究表明，在中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)飼料中添加Mn2+，雖對(duì)增長、增質(zhì)量無明顯影響，但卻能激活肝胰臟中的羧肽酶A；在皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[19-20]人工飼料中添加Ca2+、Fe3+、Mg2+等也有促生長作用。本試驗(yàn)中以多巴胺為底物，與Fe2+和Mn2+孵育后的4種酚氧化酶活性均有顯著增強(qiáng)，表明這2種金屬離子有助于仿刺參酚氧化酶的催化和酚氧化酶反應(yīng)速率的提高，由此推測(cè)，在仿刺參飼料中添加一定量的Fe2+和Mn2+可能有助于增強(qiáng)仿刺參自身免疫活力。當(dāng)Fe2+濃度高于25 mmol/L時(shí)，其他3種酚氧化酶活性上升，而AjPO7的活性出現(xiàn)明顯的下降，相比與其他3種酚氧化酶，AjPO7受二價(jià)鐵離子的影響機(jī)制可能存在特殊性。除Fe2+和Mn2+外的二價(jià)金屬離子對(duì)仿刺參4種酚氧化酶活性的影響均不顯著，這與光棘球海膽酚氧化酶活性受二價(jià)金屬離子催化的結(jié)果相近[6]，這意味著仿刺參酚氧化酶與光棘球海膽酚氧化酶受二價(jià)金屬離子影響的機(jī)制可能相似。

3.5 抑制劑對(duì)酚氧化酶活性的影響

二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌、雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用。其中，二乙基二硫代氨基甲酸鈉是特異性的銅離子螯合劑，表明本試驗(yàn)中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅[5]，這與其他無脊椎動(dòng)物酚氧化酶特性相似。然而，檸檬酸對(duì)仿刺參酚氧化酶活性的影響與其他海洋脊椎動(dòng)物如海灣扇貝(Argopectehsirradians)[16]、菲律賓蛤仔[8]、蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)[21]顯著不同，檸檬酸對(duì)雌、雄仿刺參4種酚氧化酶的抑制作用很明顯，要強(qiáng)于大多數(shù)海洋無脊椎動(dòng)物，這意味著酚氧化酶的催化機(jī)制在不同物種間并不相同，具體原因和規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

3.6 AjPO7的特異性

AjPO7作為雌性仿刺參特有的1種酚氧化酶，與其他3種酚氧化酶相比，在耐熱性以及受二價(jià)金屬離子影響方面均有其特殊性，AjPO7的這種生化特性可為仿刺參雌雄鑒別技術(shù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。仿刺參這4種酚氧化酶生化與酶學(xué)特性的研究，有助于進(jìn)一步了解仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能，并為刺參免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)在仿刺參成參體腔細(xì)胞中分離純化出4種酚氧化酶，其中雄性3種，雌性4種，分子質(zhì)量為720～1236 ku，且具有很好的耐熱性，與大多數(shù)海洋無脊椎動(dòng)物酚氧化酶的特征相同。4種酚氧化酶均屬于漆酶型酚氧化酶，并對(duì)鄰苯二酚的親和力最高。4種酚氧化酶最適pH的研究表明，仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)在弱堿性環(huán)境下活性更強(qiáng)。與Fe2+和Mn2+孵育后的4種酚氧化酶活性均有顯著增強(qiáng)。二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用，表明本試驗(yàn)中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅，與其他無脊椎動(dòng)物酚氧化酶特性相似。