劉青海，潘 虎,，朱兆靜，田 云，王 翀，達(dá)娃卓瑪，盧向陽，白軍平

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏 拉薩 850032；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一微生物分泌的酶相對較少，對纖維素的降解效果有限[1-5]。當(dāng)降解富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄秸稈時，必須協(xié)同多種微生物來分解和破壞秸稈表面的蠟質(zhì)，以利于其內(nèi)部組分與纖維素酶的接觸，加速秸稈的降解，提高生物轉(zhuǎn)化率[6]。目前，關(guān)于纖維素降解細(xì)菌的報道都集中在單一菌株的分離、純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究上[7-10]。近年來，在纖維素資源利用研究中逐漸強調(diào)了復(fù)合菌系的作用[11]。

鑒于此，本研究從西藏農(nóng)田土壤、長沙稻田腐葉堆積物中篩選纖維素酶高產(chǎn)菌,將能高效分解纖維素的細(xì)菌以不同的比例進行復(fù)合液體發(fā)酵和固體發(fā)酵,篩選構(gòu)建能用于提高堆肥效果的復(fù)合菌系,為開發(fā)高溫好氧堆肥的高效微生物菌劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 復(fù)合菌系構(gòu)建所用菌種Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)盧向陽課題組采用50 ℃高溫馴化手段，從西藏農(nóng)田土壤、長沙稻田腐葉堆積物中分離篩選。供試菌株經(jīng)鑒定分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(Z3)、假黃單胞菌(Pseudoxanthomonassp.)(Z4)、芽孢桿菌(Bacillusaestuarii)(Z6)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)(Z16)、臺灣假黃單胞菌(Pseudoxanthomonastaiwanensis)(Z33)、溫堆芽孢桿菌(Bacillusthermocopriae)(B)。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5g/L、瓊脂15 g/L、蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min。麩皮培養(yǎng)基：麩皮40%、黃豆粕10%、水50%～60%，pH值自然，124 ℃高壓蒸汽滅菌40 min。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株間拮抗分析及復(fù)合菌系構(gòu)建 將上述6株高效纖維素降解菌兩兩交叉，劃線于種子培養(yǎng)基上，50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d。如果兩菌交叉處形成無菌區(qū)，說明它們之間存在拮抗性；如果兩菌交叉處無抑菌圈，說明它們之間不存在拮抗性。將無拮抗菌株分別接種至500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，50 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，離心棄上清后收集菌體，將收集的菌體等質(zhì)量混合后得到纖維素降解復(fù)合菌系M6。

1.2.2 CMC-Na酶活性及濾紙酶活性的測定 CMC-Na酶活性的測定：取經(jīng)離心且適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL于15 mL帶有刻度的試管中，另取相同的1份粗酶液0.5 mL，在沸水浴中滅活10 min，作為對照。然后各加入1.5 mL的1% CMC-Na溶液，在50 ℃水浴中預(yù)熱5 min，然后再在50 ℃水浴放置30 min，讓纖維素酶與CMC-Na充分反應(yīng)。反應(yīng)后加入3.0 mL的DNS試劑使酶失活，沸水煮沸5 min，使DNS試劑與還原糖反應(yīng)。冷卻后用蒸餾水補充到10 mL，在540 nm波長下測定OD值，重復(fù)3次。CMC-Na酶活性=樣品中糖含量×稀釋倍數(shù)/水浴時間，求得酶活性值(1 mL酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所用的酶量為1個酶活性單位IU/mL)。

濾紙酶活性的測定：向2支試管中分別加入1.5 mL的檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L，pH值4.5)，再加入經(jīng)離心且適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，向其中1支試管中加入1.5 mL DNS試劑，作為對照。然后將2支試管同時放入50 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，之后分別加入50 mg濾紙條(新星牌定性濾紙，1 cm×6 cm)，再放回50 ℃水浴鍋中反應(yīng) 30 min。取出后向試管中加入1.5 mL DNS試劑，充分混勻后在沸水浴中加熱5 min，取出后用蒸餾水定容至10 mL，重復(fù)3次，波長540 nm下測OD值(1 mL酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 μmoL還原糖所用的酶量為1個酶活性單位IU/mL)。

1.2.3 復(fù)合菌系對秸稈降解效率的測定 稱取等質(zhì)量烘干壓碎的油菜秸稈，裝入250 mL的三角瓶中，用少量的蒸餾水打濕，121 ℃滅菌1.5 h，冷卻后將各菌株按10%的接種量接種至滅活過的油菜秸稈，加無菌水至含水率為65%左右，搖蕩均勻，使菌體與油菜秸稈充分接觸，50 ℃下恒溫培養(yǎng)，每2 d晃動1次，觀察并記錄油菜秸稈降解情況。25 d后將油菜秸稈水洗3次，除去可溶性物質(zhì)，置65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，通過質(zhì)量差計算油菜秸稈降解效率。

1.2.4 固體菌劑的制備與堆肥發(fā)酵 根據(jù)上述試驗結(jié)果選取酶活性較高、油菜秸稈降解效果較好的復(fù)合菌系M6和菌株Z3，酶活性較低、油菜秸稈降解效果較差的菌株B，不添加任何菌劑的對照(CK)4組處理進行后續(xù)堆肥發(fā)酵試驗。將菌株接種于裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，50 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵18 h，菌數(shù)達(dá)到1×1011～2×1011cfu/mL；然后按2%接種量，無菌操作接種至裝有4 kg滅菌固體麩皮培養(yǎng)基的不銹鋼淺盤(40 cm×60 cm×5 cm)，用溫度計測量固體菌劑發(fā)酵期間的溫度，重復(fù)3次，37 ℃下發(fā)酵48 h，氣流干燥至含水量介于6%～8%，菌數(shù)大于1.5×1011cfu/mL(干質(zhì)量)，風(fēng)干后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

堆肥物料以豬糞∶蘑菇渣∶煙沫質(zhì)量比6∶4∶1的比例進行混合，調(diào)節(jié)堆肥物料含水率?；旌虾蠖逊饰锪系睦砘再|(zhì)為溫度28 ℃、pH值7.4、含水率61%、有機碳含量50.44%、有機質(zhì)含量86.96%、氮含量1.79%、C/N 28.18。將上述固體菌劑與堆肥物料以質(zhì)量比1∶50混合，混勻后放置在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實訓(xùn)基地室內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在23 ℃左右，每周翻堆1次，持續(xù)堆肥發(fā)酵35 d。每天8:00和18:00記錄堆肥物料溫度、顏色及氣味變化；分別于發(fā)酵0 、7 、14 、21 、35 d，在各處理組堆肥物料的上、中、下3個不同部位采集測試樣品，將其混均破碎后備用。

1.2.5 堆肥發(fā)酵過程中各項指標(biāo)的測定 堆肥物料溫度采用玻璃水銀溫度計測定；pH值采用NY/T 1377—2007的方法測定；總有機碳含量采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定；總氮含量采用凱氏定氮法(HJ 717—2014)測定；全磷含量采用GB/T 9837—1988的方法測定；全鉀含量采用NY/T 87—1988的方法測定;記錄室溫。

1.2.6 種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的測定 稱取10 g新鮮堆肥，置于裝有100 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，200 r/min、室溫振蕩2 h、靜置，取上清液經(jīng)濾紙過濾，吸取20 mL于培養(yǎng)皿中，將2張大小合適的新星號定性濾紙平鋪于培養(yǎng)皿，待液體完全浸濕后，放入30粒顆粒飽滿的山東四號大白菜種子，以蒸餾水作為對照。每個處理重復(fù)3次，25 ℃、80%濕度條件下培養(yǎng)48 h后，測定發(fā)芽率及根長。最后用下述公式計算GI值并取3次平均值，GI值達(dá)到100%表明堆肥完全腐熟且對植物沒有毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫纖維素降解菌株的拮抗性結(jié)果

如表1所示，高溫纖維素降解菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B拮抗性結(jié)果表明，菌株Z16對菌株B有一定的抑制作用；其余菌株之間不存在拮抗性。由于菌株B對其他5菌株生長無影響，且具有一定的纖維素降解能力，故采用菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B進行復(fù)合菌系的構(gòu)建。

表1 6株高溫纖維素降解菌株的拮抗性

注：“+ ”表示兩菌能夠共同培養(yǎng)，不存在拮抗；“- ”表示兩菌之間存在或可能存在拮抗。

Note:“+”indicates that the two bacteria can be cultivated together and there is no antagonism;“-”indicates the existence of possible antagonism between the two bacteria.

2.2 CMC-Na酶活性及濾紙酶活性測定結(jié)果

在相同條件下測定菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B和復(fù)合菌系M6發(fā)酵液的CMC-Na酶活性和濾紙酶活性。從圖1可見，6株單菌株都可產(chǎn)生并分泌纖維素酶。其中，菌株Z3具有較高的CMC-Na酶活性(1.052 IU/mL)、菌株B具有較低的CMC-Na酶活性(0.172 IU/mL)，菌株Z4有較高的濾紙酶活性(0.366 IU/mL)、菌株Z33有較低的濾紙酶活性(0.165 IU/mL)；而復(fù)合菌系M6的濾紙酶活性最高(0.484 IU/mL)，其CMC-Na酶活性(0.823 IU/mL)略低于菌株Z3，但高于其他單菌株，復(fù)合菌系M6具有較好的纖維素降解活性。

圖1 單菌株和復(fù)合菌系M6 的CMC-Na和濾紙酶活性

2.3 復(fù)合菌系對油菜秸稈的降解效率

觀察單菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B和復(fù)合菌系M6對油菜秸稈的降解過程發(fā)現(xiàn)，接種各單菌株及復(fù)合菌系3 d后，油菜秸稈上均有明顯的菌體長出；25 d后，接種復(fù)合菌系M6和菌株Z3的油菜秸稈出現(xiàn)明顯的腐爛，并伴有降解小顆粒的出現(xiàn)，而不接種菌株的油菜秸稈未出現(xiàn)降解現(xiàn)象。25 d后，接種單株菌的油菜秸稈降解率均達(dá)到6.0%以上，接種復(fù)合菌系M6的油菜秸稈降解率達(dá)16.4%，其纖維素降解效果最佳(圖2)。

圖2 單菌株和復(fù)合菌系M6對油菜秸稈的降解率

2.4 堆肥物料各項指標(biāo)的測定結(jié)果

2.4.1 堆肥物料溫度的變化 4組處理的堆肥物料均呈現(xiàn)“升溫—高溫—降溫—穩(wěn)定”的趨勢。堆肥初期，由于堆肥物料中有機物等易分解物質(zhì)在微生物的作用下快速分解，導(dǎo)致溫度迅速升高，3～4 d內(nèi)達(dá)到峰值；隨后，堆肥物料進入高溫階段，整個高溫階段約持續(xù)1周；高溫階段結(jié)束后，堆肥物料溫度逐漸降低，堆肥末期，堆肥物料溫度趨于恒定室溫(圖3)。4組處理堆肥物料溫度的主要差別在于添加不同菌株可達(dá)到的最高溫度及高溫期(>55 ℃)的持續(xù)時間，CK溫度峰值(58.2 ℃)較其他處理推遲24 h，且小于其他處理，高溫期持續(xù)時間也相對較短；而添加復(fù)合菌系M6的堆肥物料在堆肥的第3天迅速達(dá)到溫度峰值(63.7 ℃)，且高于其他3組處理的最高溫度，其高溫期持續(xù)8 d，復(fù)合菌系M6處理較其他處理具有較高的溫度及較長的高溫時間，有利于殺死豬糞中的病原體，促進有機堆肥物料的快速降解與腐熟。

圖3 堆肥物料溫度的變化

2.4.2 堆肥物料pH值的變化 4組處理在堆肥發(fā)酵過程中pH值呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，堆肥結(jié)束后，4組處理堆肥物料pH值穩(wěn)定在7.8～8.6，呈弱堿性，接種復(fù)合菌系M6、菌株Z3和菌株B的3組處理的pH值較CK高(圖4)。大量研究表明，長期施用化肥會導(dǎo)致土壤酸化，造成作物生長障礙。本研究結(jié)果顯示，接種微生物的堆肥物料pH值呈現(xiàn)弱堿性，對酸化土壤具有一定的緩解作用。

圖4 堆肥物料pH值的變化

2.4.3 堆肥物料總有機碳含量的變化 由圖5可見，堆肥物料總有機碳的含量在發(fā)酵0～14 d總體呈快速下降趨勢，隨后堆肥物料總有機碳含量逐漸進入相對穩(wěn)定階段，至堆肥結(jié)束，4組處理總有機碳含量維持在32.77%～38.68%。添加復(fù)合菌系M6的堆肥物料總有機碳含量由50.44%下降至32.77%，總有機碳含量減少17.67 個百分點；CK堆肥物料總有機碳含量由50.44%下降至38.68%，總有機碳含量減少11.76個百分點；菌株Z3、B處理的堆肥物料總有機碳含量的變化曲線均在復(fù)合菌系M6處理和CK之間。上述結(jié)果表明，添加高活性復(fù)合菌系M6后，有機物的降解速率較快，導(dǎo)致堆肥物料總有機碳含量下降較快，復(fù)合菌系M6對有機物的降解效果最佳。

圖5 堆肥物料總有機碳含量的變化

2.4.4 堆肥物料總氮含量的變化 由圖6可見，隨著堆肥時間的延長，堆肥物料中總氮含量呈現(xiàn)先下降后緩慢升高的趨勢。堆肥初始階段，堆肥物料中總氮含量約為1.79%，經(jīng)過7 d的發(fā)酵，4組處理堆肥物料中總氮含量均呈現(xiàn)不同程度降低，堆肥7 d后，堆肥物料全氮含量緩慢升高，發(fā)酵結(jié)束后穩(wěn)定在2.23%～2.35%，4組處理堆肥物料中總氮含量均高于起始堆肥物料中的總氮含量。

圖6 堆肥物料總氮含量的變化

2.4.5 堆肥物料碳氮比(C/N)的變化 C/N反映發(fā)酵期間堆肥物料碳和氮含量的相對變化，是評價堆肥物料腐熟程度的重要參數(shù)。一般認(rèn)為，初始C/N為25～30較好，有利于微生物作用，末期降至15～20表示堆肥物料腐熟程度較好。由圖7可見，4組處理堆肥物料C/N均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，堆肥物料向著穩(wěn)定化和腐熟化方向轉(zhuǎn)變，發(fā)酵35 d后添加復(fù)合菌系M6的堆肥物料C/N最小(14.19)，較發(fā)酵初始下降了13.99。由此可見，添加復(fù)合菌系M6的堆肥物料較其他處理腐熟程度高。

圖7 堆肥物料C/N值的變化

2.4.6 發(fā)酵結(jié)束后堆肥物料養(yǎng)分含量測定結(jié)果 由圖8可見，堆肥結(jié)束后各處理總氮含量大致相同，介于2.23%～2.35%；復(fù)合菌系M6和菌株Z3處理的堆肥物料中五氧化二磷含量較高，而其他處理五氧化二磷含量不足6.00%；各處理氧化鉀含量大致相同，介于4.15%～4.37%。綜合總氮、五氧化二磷、氧化鉀含量，CK、復(fù)合菌系M6、菌株Z3、菌株B處理總養(yǎng)分含量分別為11.24%、13.27%、12.60%、11.94%，4組處理總養(yǎng)分含量均達(dá)到我國有機肥總養(yǎng)分含量行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(有機肥總養(yǎng)分含量≥5.0%)，其中，復(fù)合菌系M6處理堆肥物料總養(yǎng)分含量明顯高于其他處理，說明添加復(fù)合菌系M6的堆肥物料發(fā)酵效果較好。

圖8 堆肥結(jié)束后各處理中養(yǎng)分含量

2.4.7 堆肥物料GI值的變化 由圖9可見，隨著發(fā)酵時間的延長，4組處理的GI值均呈上升趨勢。復(fù)合菌系M6處理的堆肥物料起始GI值為21%；發(fā)酵的前14 d GI值迅速升高，在第14天時已經(jīng)達(dá)到98%；隨后，GI值較緩上升直至趨于穩(wěn)定；堆肥末期，GI值保持在107%；CK堆肥物料GI值的變化趨勢總體與復(fù)合菌系M6處理相似，但在堆肥末期，其GI值為94%，存在一定的植物毒性。4組處理中，復(fù)合菌系M6處理的堆肥物料GI值始終高于其他處理，原因可能是由于復(fù)合菌系微生物對堆肥物料中有機質(zhì)充分降解，堆肥物料腐熟后成分趨于穩(wěn)定，適合種子的生長發(fā)育。

圖9 堆肥物料GI值的變化

3 討論與結(jié)論

本研究從西藏農(nóng)田土壤和長沙稻田腐葉堆積物中篩選出6株高溫纖維素降解菌，構(gòu)建了纖維素高效降解復(fù)合菌系M6。復(fù)合菌系M6具有較好的CMC-Na酶活性和濾紙酶活性，在50 ℃下發(fā)酵25 d時，接種復(fù)合菌系M6的油菜秸稈降解率可達(dá)16.4%，其纖維素降解效果最佳。崔宗均等[12]篩選并馴化的纖維素分解復(fù)合菌系MX1，發(fā)酵72 h對濾紙的降解率能夠達(dá)到94.0%；王偉東等[13]通過限制培養(yǎng)技術(shù)馴化了高效纖維素降解復(fù)合菌系wsc-6，發(fā)酵72 h對濾紙酶的降解率為97.0%，對稻草的降解率為28.2%；張瑞清等[14]研究發(fā)現(xiàn)，2種菌株混配可將小麥秸稈的分解率提高到47%，纖維素分解是多種菌株協(xié)同作用的結(jié)果；劉甲峰等[15]篩選的復(fù)合菌系RSS-4，對稻草、纖維素、半纖維素的降解率分別達(dá)到45.0%、55.5%、44.1%；王海濱等[16]構(gòu)建了由微桿菌屬、鏈霉菌屬、弗留明拜葉林克氏菌、芽胞桿菌屬、毛殼菌屬組成的復(fù)合菌系，該復(fù)合菌系固態(tài)發(fā)酵20 d后，對稻稈、苦參殘渣降解率分別達(dá)到63.1%、31.4%，復(fù)合菌系顯著增加的微生物對纖維素的降解具有促進作用；李靜等[17]發(fā)現(xiàn)2組復(fù)合菌系對玉米秸稈的降解率分別可達(dá)31.8%、27.6%，2組復(fù)合菌系較單菌株對秸稈的降解率分別提高50.71%、41.54%；?？×岬萚18]研究表明，在堆肥物料中接種纖維素復(fù)合菌系，可以在一定程度上促進堆肥物料中木質(zhì)素的分解；崔詩法等[19]從枯樹葉中篩選出纖維素分解復(fù)合菌系St-13，該復(fù)合菌系較單一菌株使濾紙酶完全崩解時間大大縮短；邱向陽等[20]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系可較快啟動濾紙酶的降解過程。本研究結(jié)果與上述報道較為一致。

復(fù)合菌系M6處理的堆肥物料較其他處理具有較高的溫度及較長的高溫時間，在堆肥的第3天迅速達(dá)到溫度峰值(63.7 ℃)，其高溫期可持續(xù)8 d，有利于殺死豬糞中的病原體，促進有機物料的快速降解和腐熟；李敬波[21]研究發(fā)現(xiàn)，微生物復(fù)合菌系處理較對照提前1 d達(dá)到高溫期(>55 ℃)；沈根祥等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用微生物劑處理堆肥物料，其溫度迅速升高，高溫期延長2～3 d；竹江良等[23]研究發(fā)現(xiàn)，微生物的加入縮短了煙葉廢棄物堆肥物料達(dá)到高溫的時間，延長了熱解持續(xù)時間，提高了總氮、NH4+-N含量和C/N、GI值升高，提高了煙葉廢棄物堆肥物料的成熟程度。

本研究表明，復(fù)合菌系M6處理的堆肥物料pH值呈弱堿性，與其他處理差別不明顯。堆肥末期，復(fù)合菌系M6處理總有機碳含量由50.44%下降至32.77%；其總氮含量由1.79%升高到2.28%；C/N由28.18下降至14.19；堆肥末期，總養(yǎng)分含量為13.27%，高于其他處理；其GI值始終高于其他處理，堆肥末期保持在107%。王偉東等[13]在研究復(fù)合菌系對堆肥物料的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進行，其C/N由初始的33.5逐步降低到20.0左右，堆肥發(fā)酵過程中，復(fù)合菌系處理的C/N均低于不接菌處理，接種微生物對堆肥物料的pH值、水分含量和溫度影響較??；沈根祥等[22]研究發(fā)現(xiàn)，微生物處理較常規(guī)處理，可使種子發(fā)芽勢、作物生長指數(shù)和根系建立指數(shù)等顯著提高，添加微生物菌劑可提高堆肥物料初期微生物的分解速率，降低堆肥物料的植物毒性，使其更易分解；李敬波[21]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系對堆肥物料pH值影響較小，其C/N和有機質(zhì)含量較對照降低，接種復(fù)合菌劑可加快堆肥腐熟進程，縮短堆肥物料腐熟時間，提高種子GI值等。上述報道與本研究結(jié)果較為一致。木質(zhì)纖維素在自然界中的降解是真菌、細(xì)菌和相應(yīng)的微生物群落相互作用的結(jié)果[24]，復(fù)雜的微生物菌群較單一的細(xì)菌、真菌和放線菌具有較高的纖維素分解活性[25-27]，本研究構(gòu)建的復(fù)合菌系M6具有較好的纖維素降解能力，復(fù)合菌系M6處理的堆肥物料具有較好的腐熟度及品質(zhì)，對纖維素等有機肥料的降解利用研究具有一定的指導(dǎo)意義，但其不同菌株之間的協(xié)同機制仍有待進一步研究探討。