高鵬飛,劉 虹，叢唯一，曾繁城，杜小彥，溫 鋼，付 凈

(1.吉林化工學(xué)院資源與環(huán)境工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林省環(huán)境科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春130012；3.吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

石油污染是最常見的環(huán)境污染問題之一，石油是碳?xì)浠衔锖头翘細(xì)浠衔锝M成的復(fù)雜混合物，包括烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴等多種物質(zhì)[1]，其中苯、萘、蒽及它們的衍生物等均為具有致癌、致畸和致突變特性的潛在化學(xué)物質(zhì)[2]。石油污染物一旦進(jìn)入環(huán)境，將破壞土壤和地下水的物理化學(xué)性質(zhì)及使用功能，且環(huán)境中石油污染物的有毒組分經(jīng)食物鏈富集，會(huì)對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[3-5]。石油污染環(huán)境的修復(fù)技術(shù)通常有物理、化學(xué)和微生物技術(shù)。其中，微生物技術(shù)是一種高效、廉價(jià)、多功能的修復(fù)技術(shù)，其關(guān)鍵因素取決于土著微生物種群或接種的外源微生物菌群的降解能力[6-7]。通常，單一菌株很難將石油烴類物質(zhì)完全降解，且其適應(yīng)環(huán)境的能力較差?；旌衔⑸锶郝渫ǔ＞哂懈鼜?qiáng)大的生物降解潛力，因?yàn)槎喾N生物的代謝特征不同，從而不同的菌株擁有不同的降解能力，如吸附能力、乳化能力等,且不同菌株間可能具備協(xié)同降解能力，所以將多種微生物復(fù)配、構(gòu)成混合菌群，用于石油污染的微生物修復(fù)，將更有利于污染區(qū)域中石油烴的降解[8]。

關(guān)于石油烴微生物降解及微生物修復(fù)已有大量的研究，主要集中于石油烴降解菌株的分離、篩選、鑒定及其降解特性和機(jī)制等方面[9-10]。在石油烴降解菌株的復(fù)配方面，國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道了將不同種菌株混合用于油泥及石油污染土壤的修復(fù)，去除其中的總石油烴及多環(huán)芳烴，例如Kasakova等[11]將惡臭假單胞菌和紅球菌混合，用于油泥中多環(huán)芳烴等物質(zhì)的降解，35 d對(duì)多環(huán)芳烴的降解率達(dá)到76%；Dhote等[12]將芽孢桿菌屬和假單胞菌共培養(yǎng)，用于降解油泥中的總石油烴，其降解率達(dá)到75%；Pacwa-Pociniczak等[13]采用枯草芽孢桿菌和假單胞菌共同修復(fù)石油污染土壤，與單菌株相比，兩種菌株聯(lián)合使用對(duì)總石油烴的去除率提高了3倍；Asadirad等[14]將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合用于石油烴的降解，10 d對(duì)石油烴的降解率達(dá)77.5%。上述研究主要是將石油烴降解菌混合，研究混合菌株對(duì)石油烴或某種組分的降解效果，而未研究菌株間的復(fù)配比例及其協(xié)同降解作用，且采用的菌株主要有惡臭假單胞菌、紅球菌、芽孢桿菌屬、假單胞菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等。為此，本文選取新的菌株：微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌YH、類產(chǎn)堿假單胞菌TM和紅球菌K1，將3種菌株以不同的比例進(jìn)行復(fù)配，且對(duì)其間的協(xié)同降解作用進(jìn)行分析，研究3種單菌株及其復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解效果，以為石油烴污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 主要試驗(yàn)試劑

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2。

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 000 mg/L，K2HPO41 550 mg/L，NaH2PO4850 mg/L，MgCl2·6H2O 100 mg/L，EDTA 10 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 2.0 mg/L，MnCl2·2H2O 1.0 mg/L，CaCl2·2H2O 1.0 mg/L，CoCl2·6H2O 0.4 mg/L，NaMoO4·2H2O 0.2 mg/L，CuSO4·5H2O 0.2 mg/L。

磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH值7.0)：39 mL 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O 溶液與61 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O 溶液混勻即得。

原油培養(yǎng)基：100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入1 mL柴油(0#柴油，中國(guó)石化)，濃度為7.7 g/L。

富集培養(yǎng)基：無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入5 g/L的葡萄糖，1 g/L的酵母膏，pH值7.0。

1.2 試驗(yàn)菌株

菌株來源：試驗(yàn)所用菌株從松原油田石油污染土壤樣品中篩選、分離而得。篩選、分離條件為：采集松原油田石油污染區(qū)不同地點(diǎn)土壤樣品進(jìn)行混合，取土壤混合樣品10 g，用無菌水90 mL懸浮，磁力攪拌子高速攪拌10 min，再用8層紗布過濾掉雜物碎泥，靜止1 h。

首先取10 mL 懸浮液接入 100 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min 搖瓶培養(yǎng)10 d，由于采集的土壤樣品受到石油烴污染，其石油烴含量為10 mg/kg，所以不需要另外添加石油烴；然后取10 mL上述培養(yǎng)液接入100 mL原油培養(yǎng)基中，30℃、130 r/min搖瓶培養(yǎng)，待觀察到以上培養(yǎng)基中有混濁時(shí)，培養(yǎng)完畢，搖勻，再取培養(yǎng)液10 mL轉(zhuǎn)接至新的馴化培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，反復(fù)轉(zhuǎn)接12次進(jìn)行培養(yǎng)，馴化時(shí)間共計(jì)3個(gè)月；最后將馴化后的菌株懸液涂布于無機(jī)鹽固體平板上，以柴油為碳源，在30℃下培養(yǎng)3 d后，將長(zhǎng)出的單菌株落接種至普通固體平板中進(jìn)行劃線分離數(shù)次，30℃下培養(yǎng)，直至分至純菌株，接種斜面培養(yǎng)基保藏。分離、篩選出的3種優(yōu)勢(shì)降解菌株，選擇同源性大于98%的基因序列，經(jīng)16S rDNA鑒定，3種菌株分別為：微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila) YH、類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)TM和紅球菌(Rhodococcussp.)K1，冷藏保存。

1.3 主要儀器設(shè)備

試驗(yàn)所用儀器設(shè)備為：LD4-2A 醫(yī)用離心機(jī)；氣相色譜儀(島津GC2014)；手提式壓力蒸汽滅菌器；SP-DJ系列垂直凈化工作臺(tái)HZQ-QX 全溫振蕩器；JMS-6700F 場(chǎng)發(fā)射掃描儀；DHG-9320A鼓風(fēng)干燥箱；DPN-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌落、菌體形態(tài)觀察

將3種菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基后130 r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)24 h作為菌株懸液，分別將各菌株菌懸液稀釋至10-8后取50 μL涂布于LB固體平板，電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落大小及其形態(tài)。

將3種菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取40 mL于離心管中以6 000 r/min離心5 min，沉淀用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖液中。各菌株采用JMS-6700F場(chǎng)發(fā)射掃描儀進(jìn)行電子顯微鏡掃描成像，觀察菌株大小及其形態(tài)。

2.2 菌株的復(fù)配及其對(duì)石油烴的降解效果測(cè)定

石油烴降解菌株的復(fù)配試驗(yàn):將3種單菌株和兩兩組合以及3種菌株混合共組建了7個(gè)處理組，然后按照 1∶1的比例將菌懸液混合接種到含有2 000 mg/L 0#柴油的 100 mL培養(yǎng)基中，其中不加菌株作為空白對(duì)照，130 r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)6 d后每隔1 d取7個(gè)不同菌株樣品和空白樣測(cè)定總石油烴(TPH)的殘留量，并計(jì)算總石油烴的降解率。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行樣?？偸蜔N降解率的計(jì)算公式如下：

(1)

式中：η為總石油烴的降解率(%)；C0為空白對(duì)照的石油烴質(zhì)量濃度(mg/L);C1為降解后的石油烴質(zhì)量濃度(mg/L)。

通過對(duì)比單菌株與混合菌株對(duì)石油烴的降解率的大小可以得出菌株間的協(xié)同與拮抗作用，再分別將3種菌株以不同的比例(YH∶TM∶K1)0.5∶1∶1.5、0.5∶1.5∶1、1.5∶0.5∶1、1.5∶1∶0.5、1∶0.5∶1.5、1∶1.5∶0.5進(jìn)行復(fù)配，考察復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解效果。

2.3 復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解動(dòng)力學(xué)研究

將最佳復(fù)配菌株接種到不同石油烴濃度(400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L)的菌懸液中，考察復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴降解效果的影響，并根據(jù)復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴的降解曲線，研究其降解動(dòng)力學(xué)。

2.4 總石油烴(TPH)的測(cè)試分析方法

石油烴的前處理提取方法：取培養(yǎng)液樣品50 mL，加入10 mL正己烷進(jìn)行液液萃取(萃取1次，不濃縮，回收率大于98%)。萃取后的有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，采用配備氫火焰離子化檢測(cè)器的氣相色譜儀(GC-FID)測(cè)定總石油烴(TPH)的殘留量。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度為280.0 ℃，載氣為氮?dú)?，壓力?9.5 kPa，總流量為37.7 mL/min；分流比為20.0；采用Rtx-1色譜柱，30.0 m×0.25 μm×0.32 mm，柱流量為1.65 mL/min，初始溫度80.0℃下平衡3.0 min，按8℃/min升溫速率升溫至100℃，再按10℃/min升溫速率升溫至200 ℃，最后按15℃/min升溫速率升溫至280 ℃平衡15 min，總程序?yàn)?5.85 min；柱箱最大溫度為330 ℃；FID檢測(cè)器溫度為290.0 ℃；進(jìn)樣體積為1.0 μL。

總石油烴(TPH)的定量分析：選取0#柴油作為標(biāo)準(zhǔn)油，用正己烷分別制備2 000 mg/L、1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L的溶液，并繪制其工作曲線，以色譜圖中總峰面積(y)對(duì)石油烴濃度(x)進(jìn)行線性回歸，作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，兩者之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。本方法檢測(cè)限為10-6g/L。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌落、菌體形態(tài)特征

3種石油烴降解菌株的菌落形態(tài)特征，見表1。

表1 3種石油烴降解菌株的菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of three petroleum hydrocarbon degradation strains

經(jīng)電子顯微鏡掃描，3種石油烴降解菌株YH、TM、K1的形態(tài)，見圖1。

圖1 3種石油烴降解菌株YH、TM、K1形態(tài)的電子 顯微鏡掃描圖Fig.1 Electron microscopy scan of three petroleum hydrocarbon degradation strains(YH,TM,K1)

由圖1可見：菌株K1為球菌，菌體大小約為0.3 μm；菌株YH、TM為桿菌，菌體大小約為0.7 μm×1 μm。

3.2 復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解效果

將3種菌株中任意2種菌株和3種菌株分別進(jìn)行等比復(fù)配，以確定降解過程中菌株間的相互作用，即通過菌株對(duì)石油烴降解率的大小可以確定菌株間的相互作用是協(xié)同還是拮抗，若協(xié)同則菌株混合后對(duì)石油烴的降解率會(huì)高于單個(gè)菌株對(duì)石油烴的降解率，拮抗則反之。通過研究菌株間的相互作用可以得出對(duì)石油烴降解效果更好的復(fù)配菌株，3種菌株中單菌株、任意2種菌株及3種菌株等比復(fù)配對(duì)石油烴的降解效果，詳見表2。

表2 3種菌株復(fù)配試驗(yàn)及其對(duì)石油烴的降解效果Table 2 Three strains compounding experiments and their degradation effects on petroleum hydrocarbons

通過分析表2可知：任意2種菌株(1∶1)混合后對(duì)石油烴的降解率分別為84.5%、85.4%、86.2%，均高于單個(gè)菌株的降解率81.2%、79.8%、82.1%；3種菌株(1∶1∶1)混合后對(duì)石油烴的降解率為90.7%，均高于任意2種菌株(1∶1)混合后對(duì)石油烴的降解率，表明3種菌株的混合對(duì)石油烴污染環(huán)境具有更強(qiáng)的降解能力。

由于石油烴是一種復(fù)雜的混合物，含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴等)，一種微生物通常只對(duì)特定的石油成分具有較強(qiáng)的降解能力[15]，因此3種菌株復(fù)配對(duì)石油烴的降解效果明顯；同時(shí)，這表明微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌S.acidaminiphilaYH、類產(chǎn)堿假單胞菌P.pseudoalcaligenesTM和紅球菌Rhodococcussp.K1 3種菌株因相互適應(yīng)而在它們之間形成了一種協(xié)同降解石油烴的機(jī)制，因此在混合后表現(xiàn)出更佳的降解效果[16]。相關(guān)文獻(xiàn)研究表明：紅球菌在單一組分十二烷、十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，其中紅平紅球菌和慶笙紅球菌還能在芘的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)[17]；假單胞菌屬對(duì)正十四、正十五及正十六烷烴的降解率均達(dá)80%以上，且對(duì)正十六烷的降解率高達(dá)95.9%，對(duì)、芘、蒽和菲的降解效率分別可達(dá)86.0%、80.2%、91.4%和94.5%[18]。而關(guān)于微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴以及以上3種菌株的復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解研究鮮有報(bào)道，僅有對(duì)石油烴降解菌株間協(xié)同降解的相關(guān)研究，如Patowary等[19]從印度的石油污染土壤中分離出多種石油烴降解菌株，并將這些降解菌株聯(lián)合使用，用于原油污染土壤的微生物修復(fù)，經(jīng)過5周的降解試驗(yàn)，對(duì)總石油烴的降解率高達(dá)84.15%，清除了大部分石油烴。

微生物菌株的復(fù)配比例是提高石油烴降解效果的關(guān)鍵所在，只有調(diào)整到最佳配置比例，才能獲得復(fù)合微生物菌株對(duì)石油烴的最佳降解效果，3種菌株以不同的比例進(jìn)行復(fù)配對(duì)石油烴的降解效果，見圖2。

圖2 3種菌株不同的復(fù)配比例對(duì)石油烴的降解效果Fig.2 Degradation effect of different proportions of three strains on petroleum hydrocarbons

由圖2可見，3種菌株的復(fù)配比例(YH∶TM∶K1)為1∶0.5∶1.5時(shí)對(duì)石油烴的降解效果最好，其降解率高達(dá)94.3%。這可能是因?yàn)檫@3種菌株在該復(fù)配比例時(shí)能夠更好地相互利用營(yíng)養(yǎng)源，單菌株產(chǎn)生的胞外酶和酶解基質(zhì)的產(chǎn)物會(huì)迅速在環(huán)境中稀釋，不能為種群所利用，而多種菌株復(fù)配，種群間的微生物可以利用其他微生物產(chǎn)生的基質(zhì)，促進(jìn)彼此生長(zhǎng)，從而進(jìn)一步提高了石油烴的降解率[20]。

3.3 復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解動(dòng)力學(xué)研究

石油烴濃度過大，將會(huì)對(duì)許多石油烴降解菌株產(chǎn)生抑制作用，甚至導(dǎo)致大量菌體死亡[21]；石油烴濃度過低，則不能為菌株提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使菌株生長(zhǎng)受到限制。本文考察了當(dāng)石油烴初始濃度分別為2 000 mg/L、1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L時(shí)復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解效果。復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴的降解曲線見圖3，通過對(duì)圖3的降解曲線進(jìn)行擬合，得到復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴的降解動(dòng)力學(xué)擬合方程和降解半衰期(t1/2)，見表3。

圖3 復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴的降解曲線Fig.3 Degradation curves of petroleum hydrocarbons with different initial concentrations by compound strains表3 復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴的降解動(dòng)力學(xué) 擬合方程和降解半衰期Table 3 Kinetic fitting equations and degradation hafe life for the degradation of petroleum hydrocarbons with different initial concentrations by compound strains

石油烴的初始濃度(mg·L-1)降解動(dòng)力學(xué)擬合方程反應(yīng)級(jí)數(shù)t1/2/dR22 000y=-309.6x+2 045.003.40.9311 000lny=-0.447x+7.42712.70.994800lny=-0.434x+6.94912.20.976600lny=-0.411x+6.62312.20.982400lny=-0.391x+6.24612.40.991

由圖3和表3可見，復(fù)配菌株對(duì)不同初始濃度石油烴的降解效果有所差異，但降解率都高于90%，證明復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解效果良好；當(dāng)石油烴的初始濃度為2 000 g/L時(shí)，復(fù)配菌株的降解動(dòng)力學(xué)曲線與零級(jí)動(dòng)力學(xué)過程的擬合效果良好，這表明石油烴殘留濃度隨著時(shí)間的增加呈線性降低；當(dāng)石油烴的初始濃度分別為1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L時(shí)，復(fù)配菌株的降解動(dòng)力學(xué)曲線與一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的擬合效果良好，其降解半衰期t1/2為2.2～2.7 d。

4 結(jié) 論

(1) 本試驗(yàn)選取新的菌株：微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌YH、類產(chǎn)堿假單胞菌TM和紅球菌K1，對(duì)3種菌株以不同的比例進(jìn)行復(fù)配，考察了單菌株與復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解效果。結(jié)果表明：復(fù)配后的菌株對(duì)石油烴的降解效果均優(yōu)于單菌株，且3種菌株對(duì)石油烴具有協(xié)同降解能力。

(2) 通過對(duì)3種菌株不同的復(fù)配比例(YH∶TM∶K1)0.5∶1∶1.5、0.5∶1.5∶1、1.5∶0.5∶1、1.5∶1∶0.5、1∶0.5∶1.5、1∶1.5∶0.5時(shí)對(duì)石油烴的降解效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明：當(dāng)復(fù)配菌株的復(fù)配比例(YH∶TM∶K1)為1∶0.5∶1.5時(shí)對(duì)石油烴的降解效果最好；初始濃度為2 000 mg/L的石油烴，加入復(fù)配菌株，在130 r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)6 d后，總石油烴的降解率為94.3%。

(3) 復(fù)配菌株對(duì)石油烴的降解動(dòng)力學(xué)研究表明：當(dāng)石油烴的初始濃度為2 000 g/L時(shí)，復(fù)配菌株降解動(dòng)力學(xué)曲線與零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的擬合效果良好；當(dāng)石油烴的初始濃度分別為1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L時(shí),復(fù)配菌株降解動(dòng)力學(xué)曲線與一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的擬合效果良好，其降解半衰期為2.2～2.7 d。