金 憶 胡小雪2 楊澤勇

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院麻醉科-上海市胚胎源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200030;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉科 上海 200052)

孕婦反復(fù)或長期暴露于麻醉藥物可能對發(fā)育中的嬰兒產(chǎn)生神經(jīng)毒性,但其機(jī)制仍不清楚[1]。七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉劑,使用方便、麻醉效果佳、呼吸道刺激小,是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的吸入麻醉藥物。七氟醚可能會對大腦發(fā)育產(chǎn)生影響,從而引起行為障礙,該過程的病理機(jī)制可能涉及氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥、突觸性質(zhì)改變等。我國每年有超過1 000萬孕婦接受麻醉,懷孕期間重復(fù)或長期麻醉藥物暴露會導(dǎo)致發(fā)育神經(jīng)的損害和子代的認(rèn)知功能紊亂。長時(shí)間吸入麻醉對腦部神經(jīng)突觸有損傷作用[2],特別是對未成熟的神經(jīng)元會導(dǎo)致明顯的神經(jīng)損害[3-4]。長時(shí)間接觸高濃度七氟醚會改變新生大腦中的葡萄糖和氨基酸代謝過程及細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑與滲透物質(zhì)系統(tǒng)[5],降低脂質(zhì)中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油,并增加4-羥基非烯醇[6],而磷脂酰絲氨酸參與神經(jīng)元存活、神經(jīng)突起生長和突觸形成有關(guān)的信號通路[7-10]。已知脂質(zhì)的異常變化可能會打破磷脂的平衡,大部分吸入麻醉藥都是脂溶性的,易透過胎盤屏障。探討藥物誘導(dǎo)損傷模型中新的生物標(biāo)志物,特別是從腦和血清樣本中識別出新的生物標(biāo)志物,可能有助于早期發(fā)現(xiàn)麻醉藥物暴露的潛在神經(jīng)毒性。目前對于吸入七氟醚后子代神經(jīng)發(fā)育的影響存在爭議,孕期大鼠持續(xù)吸入七氟醚后,有些子代神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了凋亡和行為學(xué)的改變[11],但也有一些實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果。因此,母代孕晚期接觸七氟醚是否會引起子代神經(jīng)發(fā)育的障礙需要進(jìn)一步的科學(xué)探索。本研究首次通過脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討七氟醚對子代發(fā)育神經(jīng)的潛在毒性機(jī)制。利用超高效液相色譜質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry,UPLC/MS)技術(shù)從脂質(zhì)組學(xué)方面來明確哪一種脂質(zhì)代謝參與神經(jīng)潛在損傷的發(fā)生,通過RNA-Seq進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因,并使用RT-qPCR在損傷模型上進(jìn)一步驗(yàn)證損傷過程中對應(yīng)基因的變化。

材料和方法

麻醉和試劑動(dòng)物研究(包括大鼠安樂死程序)按照上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)程執(zhí)行(編號:SMP-ADM-000-A),我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的許可證號(編號:A 2016077),遵循國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評估及認(rèn)可委員會(AAALAC)和動(dòng)物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)委員會(IACUC)的規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物護(hù)理。

孕15～17天的SD大鼠(體質(zhì)量400～500 g)購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,無病毒、細(xì)菌和寄生蟲病原體。將孕大鼠單獨(dú)放入標(biāo)準(zhǔn)箱房中飼養(yǎng),喂食顆粒飼料(江蘇醫(yī)藥生物工程有限公司)和高溫殺菌純凈水。飼養(yǎng)條件:溫度(23±2)℃,相對濕度50%±15%,12 h光暗輪替,空氣壓力100 kPa,15次/h空氣完全過濾一次。試劑:HPLC級乙腈和甲酸(美國Merck公司),TOF-MS校準(zhǔn)液(美國AB SCIEX公司),超純水來源于Milli-Q純凈水系統(tǒng)(美國米利波公司)。

實(shí)驗(yàn)分組將28只孕大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(S組)和對照組(C組),每組14只。飼養(yǎng)1～3天后,S組孕大鼠在麻醉箱內(nèi)接受2%七氟醚+98%氧氣6 h;C組孕大鼠在麻醉箱內(nèi)以相同的流速吸入100%氧氣6 h,總氣體流量為400 mL/min,用氣體分析儀(德國Drager公司)測定氧、二氧化碳和七氟醚的濃度。七氟醚麻醉終止后,每組隨機(jī)取8只孕大鼠,腹主動(dòng)脈血樣采集40 μL,用I-STAT 1分析儀(MN:300-G,美國Abbott Park公司)分析血?dú)?。其余孕大鼠回飼養(yǎng)箱內(nèi)等待分娩,S組子代43只,C組子代48只,每組隨機(jī)抽出12只出生后7天的子代大鼠,七氟醚麻醉,2組新生大鼠斷頭后采集血清標(biāo)本,即刻在冰面上取出海馬和皮層組織。血清標(biāo)本、海馬及皮層組織于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品制備和UPLC/TOF-MS12 000*g離心(4 ℃) 10 min獲得子代血清樣本,取10 μL轉(zhuǎn)移到無菌的EP管中,加入10 μL優(yōu)質(zhì)等級純水及5 μL異丙醇(10 μg/mL),用40 μL冷異丙醇+1 %甲酸(v/v)進(jìn)行旋渦混合,沉淀蛋白質(zhì)。-20 ℃靜置20 min,13 000*g離心10 min,取10 μL上清液轉(zhuǎn)移到玻璃式HPLC小瓶(96孔板)中進(jìn)行衍生化,采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析。用電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)在正離子模式下進(jìn)行LC-MS檢測,用多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)對每種化合物進(jìn)行定量分析。色譜分析采用ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司)分析,水同步高清晰度飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)系統(tǒng)(美國Waters公司)陰極ESI源在UPLC上以正負(fù)模式顯示,IDA模型用于正負(fù)離子模式,由TOF-測量掃描(m/z=100)和緊隨6次TOF-MS/MS掃描(m/z=100～1 500)組成,累積時(shí)間分別為0.08 s和0.1 s,以確保測量質(zhì)量的精確性。

PLS-DA分析在代謝組學(xué)分析之前,使用Marker View軟件(美國AB SCIEX公司)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,并將其歸一化為總面積,以糾正每個(gè)樣本的濃度偏差。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)方法進(jìn)行檢測,比較樣本間差異,確定關(guān)鍵化合物,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。獲取包含樣本變量的數(shù)據(jù)矩陣,以分析下一個(gè)代謝物。在PLS-DA模型中可變影響的化合物預(yù)測值(Vip)>1.0和P<0.05獲得潛在生物標(biāo)記物[12]。

HE染色對6只新生大鼠的海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行HE染色,檢測細(xì)胞凋亡。切片去蠟,水合,HE染色。切片脫水、包埋,400倍顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下計(jì)數(shù)CA1錐體細(xì)胞數(shù)目并拍照,僅包括細(xì)胞核和核仁明顯的細(xì)胞。

TUNEL染色將6只新生大鼠海馬和皮層組織制成冰凍切片,浸泡在含3% H2O2的PBS中,消除內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)。PBS(pH=7.4)洗滌3次、每次5 min,加入20 % FBS和3 %FBS蛋白15 min。加入與熒光素連接的TUNEL反應(yīng)液,切片置于37 ℃加濕箱中1 h,PBS洗滌3次,每次5 min。切片在室溫下與終止液反應(yīng)10 min,在37 ℃下與抗地高辛過氧化物酶抗體反應(yīng)30 min,PBS洗滌3次,每次5 min。再用DAB(3,3’-二氨基聯(lián)苯胺)顯影,二甲苯透明后用中性樹脂密封。切片置于熒光顯微鏡下拍照,并觀察TUNEL陽性染色結(jié)果。

RNA提取將6只新生大鼠的皮層組織塊與少量液氮混合后迅速研磨,重復(fù)3次。將皮層組織細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上,加入Trizol裂解5～10 min。4 ℃下12 000*g離心15 min,吸取上層水相,移至另一離心管中,按Trizol∶異戊醇=1∶0.6 (v/v)混勻,室溫放置5～10 min。4 ℃下12 000*g離心10 min,棄上清,按Trizol∶75 %乙醇=1∶1(v/v)溫和振蕩,懸浮沉淀。室溫晾干或真空干燥5～10 min,檢測260 nm下吸光度(D)值,定量RNA濃度。

RNA-seq實(shí)驗(yàn)流程提取的總 RNA 樣品經(jīng)瓊脂糖電泳和 Nanodrop 質(zhì)檢及定量后,用 oligo(dT)磁珠富集 mRNA,若 RNA 為降解樣品或?yàn)樵藰悠穭t直接用 rRNA 去除試劑盒進(jìn)行處理;RNA 測序文庫均由試劑盒完成,包括 RNA 片段化后用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)生成第一鏈 cDNA,加入 dUTP 合成第二鏈 cDNA,雙鏈 cDNA 末端修復(fù)加 A 后連接 Illumina 匹配接頭,PCR 擴(kuò)增得到最終文庫;構(gòu)建好的文庫用 Agilent 2100進(jìn)行質(zhì)檢,并由 qPCR 方法進(jìn)行文庫定量,使用 Illumina Hiseq 4000 測序儀進(jìn)行測序。

結(jié) 果

動(dòng)脈血?dú)夥治鰹橄脱跹Y或二氧化碳蓄積等因素干擾,對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?表1),血?dú)夥治鼋Y(jié)果與氧和二氧化碳交換相關(guān)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)都在正常安全范圍之內(nèi),兩組間pH值和動(dòng)脈血二氧化碳的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S組大鼠僅受七氟醚的影響而不受七氟醚麻醉所致動(dòng)脈血?dú)獾挠绊?因此動(dòng)物模型建成。

UPLC/TOF-MS分析七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性UPLC/TOF-MS分析分別采用正電離和負(fù)電離兩種模式,獲得代謝組學(xué)圖譜(圖1)。分別對每組6個(gè)QC樣品進(jìn)行測定,在負(fù)離子和正離子模式下產(chǎn)生10個(gè)生物標(biāo)記的保留時(shí)間和6個(gè)共峰的峰面積配對保留時(shí)間m/z(表2)。保留時(shí)間的RSD<3.71%,峰面積的RSD為3.62%～38.58%。

表1 兩組孕大鼠實(shí)驗(yàn)后動(dòng)脈血?dú)夥治霰容^Tab 1 Arterial blood gas analysis between two groups

C group:Control group;S group:Sevoflurane prenatal exposure group.pH:Potential of hydrogen;PaCO2:Partial pressure of carbon dioxide in arterial blood;HCO3:Carbonic acid hydrogen radical;BE:Residual value of blood alkali;SaO2:Degree of blood oxygen saturation.

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)兩組采用UPLC/TOF-MS樣品剖面進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和PLS-DA檢測。在正離子模式下獲得更好的分離效果(圖2)。采用3個(gè)參數(shù)對P的性能進(jìn)行評價(jià)。LS-DA模型在正離子模式下:R2X=0.665,R2Y=0.996,Q2=0.962,因此選擇PLS-DA模型。

表2 孕晚期暴露于七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的新生大鼠脂質(zhì)中的標(biāo)記物、通路和疾病Tab 2 Sevoflurane induces neurotoxicity potential markers and associated pathways or diseases in lipids of newborn rats in late pregnancy

RT:Retention time (min);m/z:Mass-to-charge ratio.The independentttest was verified by Graph Prism 5.0 in serum of group S and group C.P<0.05.↑:Up regulation.↓:Down regulation.

A:ESI positive mode;B:ESI negative mode.The UPLC/TOF-MS analysis was performed using an Acquity TMUPLC system coupled to a SynaptTMG2 high-definition time-of-flight mass spectrometry system with ESI positive and negative modes.In both positive and negative ion modes,basic peak chromatogram profiles displayed no difference between S and C groups.ESI:Electrospray ionization.

圖1 基于UPLC/TOF-MS分析新生大鼠血清陽性和陰性ESI的典型基峰強(qiáng)度色譜圖
Fig 1 Typical base peak intensity chromatogram of the rat serum obtained in ESI positive andnegative mode based on UPLC/TOF-MS analysis

七氟醚治療脂質(zhì)代謝途徑分析用Metabo Analyst(http://www.metaboanalyst.ca) 進(jìn)一步分析鑒定出的生物標(biāo)志物(圖3)。發(fā)現(xiàn)6條代謝途徑:甘油磷脂代謝、糖基磷脂酰肌醇(glycosylphos phatidylinositol,GPI)-錨定生物合成、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝,鞘脂代謝和花生四烯酸代謝,其中甘油磷脂代謝是最重要的代謝途徑。

HE染色和TUNEL染色TUNEL染色分析各子代大鼠海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡(圖4A、4B)。S組染色質(zhì)致密、深染,形成致密團(tuán)塊,HE染色的組織學(xué)切片中可能出現(xiàn)斷裂。細(xì)胞體積縮小,胞漿致密,嗜酸性。HE染色和TUNEL染色結(jié)果顯示兩組細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

C:PLS-DA in negative ion mode.S:PLS-DA in positive ion mode.

圖2 新生大鼠血清PLS-DA分析圖
Fig 2 The serum of neonatal rats analyzed by PLS-DA

RNA-seq技術(shù)利用RNA-seq技術(shù)對S組和C組試驗(yàn)前后轉(zhuǎn)錄本中的差異表達(dá)基因進(jìn)行全面分析(圖5),Vcan基因確實(shí)有表達(dá)上調(diào)的趨勢,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并發(fā)現(xiàn)相關(guān)差異表達(dá)顯著基因的通路(圖6):紅色為上調(diào),綠色為下調(diào),RT-qPCR驗(yàn)證Vcan基因表達(dá)上調(diào)明顯。

Pathway analysis on biomarkers of sevoflurane-induced neurogenerative disease model.All matched pathways were acquired according toPvalues from pathway enrichment analysis and pathway impact values from pathway topology analysis,using pathway library of Rattus norvegicus (rat).A:Glycerophospholipid metabolism;B:Glycosylphos phatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis Linoleic acid metabolism;C:Alpha-linolenic acid metabolism;D:Sphingolipid metabolism;E:Arachidonic acid metabolism.

圖3 七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)退行性病變疾病模型生物標(biāo)志物的通路分析
Fig 3 The pathway analysis of biological markers of theneurodegeneration disease model induced by sevoflurane

The experiment was repeated 3 times.Apoptosis in hippocampus and cerebral cortex was detected by TUNEL and HE staining.Blank:Blank group;Control:Control group;Hippocampus:Hippocampus group;Cortex:Cortex group.A and B:The black arrows indicate apoptotic cells.Observation of HE and TUNEL staining for the hippocampus and cerebral cortex tissue in morphological changes in each group (scale bar=20 μm).C and D:The statistical analysis of neural cell apoptosis was detected by TUNEL and HE staining from hippocampi and cerebral cortex tissue of each offspring rat.

圖4 各組海馬和大腦皮層組織HE染色和TUNEL染色的形態(tài)變化(*400)
Fig 4 HE and TUNEL staining for the hippocampus and cerebral cortex tissue in morphological changes of each group (*400)

A:The change ofVcangene by RT-PCR;B:The melting point curve for drawing;C:The expansion regionVcangene.D:As the standard curve.

圖5Vcan基因RT-PCR變化及熔融和擴(kuò)增曲線
Fig 5Vcangene PCR RT-PCR changes,melting and amplification curves

討 論

本研究基于脂質(zhì)組學(xué),在七氟醚誘導(dǎo)子代潛在神經(jīng)損傷的過程中,發(fā)現(xiàn)6種代謝途徑,包括甘油磷脂代謝途徑、GPI-錨定生物合成、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、鞘脂代謝和花生四烯酸代謝,其中甘油磷脂代謝是最重要的代謝途徑。脂質(zhì)代謝的改變被認(rèn)為是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)鍵因素[13],血脂異常與阿爾茨海默癥、帕金森癥和亨廷頓癥等疾病有關(guān)。吸入麻醉藥異氟醚低濃度時(shí)表現(xiàn)為神經(jīng)保護(hù),高濃度時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。母體妊娠過程中暴露于七氟醚可能會對其后代的神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。本研究中,MetaboAnalyst系統(tǒng)用于進(jìn)一步分析已鑒定的生物標(biāo)志物,在S組中發(fā)現(xiàn)潛在的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物甘油磷脂和鞘磷脂。將以上3種方法與穩(wěn)定同位素標(biāo)記相結(jié)合,可用于分析脂類代謝(脂肪酸、甘油磷脂和鞘脂代謝)[15]。

甘油磷脂是參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中的主要脂類。在許多神經(jīng)退行性疾病中磷脂酰膽堿穩(wěn)態(tài)被破壞[16],當(dāng)溶血磷脂酰膽堿水平升高,可導(dǎo)致神經(jīng)鞘脫髓鞘及不同程度的軸突變性[17]。細(xì)胞內(nèi)磷脂酰膽堿含量減少,可能有助于預(yù)防或治療阿爾茨海默癥[18],在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中磷脂穩(wěn)態(tài)破壞后,磷脂失衡可導(dǎo)致許多神經(jīng)疾病。

鞘脂代謝改變最終導(dǎo)致神經(jīng)損傷。抑制PKC的溶血磷脂會產(chǎn)生神經(jīng)毒性,而且這些脂類會導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化,特別是細(xì)胞膜上脂肪通道的功能改變[19]。膜脂(如神經(jīng)節(jié)苷脂和鞘脂)與可溶性Aβ和不溶性形式相互作用[20-22],并影響Aβ神經(jīng)毒性。鞘磷脂是由游離鞘氨醇基及其磷酸鹽、神經(jīng)酰胺、鞘氨酰肌醇和復(fù)雜的鞘磷脂組成的一類不同的脂質(zhì)群類,可在神經(jīng)疾病等各種疾病中檢測到這類脂質(zhì)群[23-25]。因此,鞘脂代謝與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān),可能與神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究中,脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)產(chǎn)前接觸七氟醚對子代的潛在神經(jīng)毒性。

A and B:The KEGG pathway analyzed the top 10 item bar diagrams.InP-value order from low to high,the ordinate representsP-value(-log10 transformation);C:Pathway analysis of the first 5 Pathway of up and down significantly differentially expressed genes KEGG Pathway.Pathway analysis is a functional analysis mapping genes to KEGG pathways.TheP-value (EASE-score,Fisher-Pvalue or Hypergeometric-Pvalue) denotes the significance of the pathway correlated to the conditions.Lower theP-value,more significant is the pathway.The recommendP-value cut-off is 0.05.Upregulated differential expression gene KEGG pathway analysis results folder;Down-regulated differential expression gene KEGG pathway analysis results folder.DE:Differentially expressed.

圖6 調(diào)節(jié)基因的信號通路和差異表達(dá)顯著基因的通路
Fig 6 Signal pathway of differentially expressed genes and pathway results of differentially expressed significant genes

在轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面,本研究首次揭示七氟醚子代神經(jīng)毒性的轉(zhuǎn)錄表達(dá)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)相關(guān)差異表達(dá)顯著基因的通路,進(jìn)一步RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)孕大鼠暴露于七氟醚后,新生大鼠皮層Vcan基因表達(dá)明顯上調(diào),Vcan基因與一種名為versican的蛋白質(zhì)有關(guān)。根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中的生物學(xué)通路分類條目和基因表達(dá)情況,過表達(dá)對理解Vcan如何調(diào)控包括神經(jīng)發(fā)育、功能和修復(fù)在內(nèi)的大腦皮層潛在毒性具有重要意義[26]。

基于UPLC/TOF-MS的脂肪組學(xué)和RNA-seq測序?yàn)樘接懼|(zhì)失衡導(dǎo)致發(fā)育神經(jīng)發(fā)生相關(guān)潛在毒性提供了全面的信息。本研究中,RNA-seq技術(shù)應(yīng)用于孕晚期大鼠暴露于七氟醚對其子代的潛在神經(jīng)毒性,對精確調(diào)控七氟醚的濃度和時(shí)間有重要的意義。本研究提示異常的甘油磷脂和鞘脂代謝可能誘導(dǎo)潛在神經(jīng)毒性,產(chǎn)前接觸七氟醚所致子代潛在發(fā)育神經(jīng)毒性的病理過程還需要更多的證據(jù),調(diào)節(jié)甘油磷脂和鞘脂代謝可作為孕晚期吸入麻醉藥長時(shí)間暴露后潛在神經(jīng)損傷的治療手段。本研究為今后進(jìn)一步探討孕晚期模式動(dòng)物七氟醚暴露的脂質(zhì)代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和相關(guān)潛在神經(jīng)毒理學(xué)分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。