周慧良，甘受益，馮光瑞，李賓，宋巧巧，劉亮

左卡尼?。ㄗ笮舛緣A）主要存在于心肌和骨骼肌細胞中，具有促進脂代謝和保護心肌細胞的作用[1]。近年來研究顯示聯(lián)合使用左卡尼汀可提高對急性心肌梗死（AMI）患者的臨床效果[2]。由于心肌缺血引起的氧化應激反應和炎癥反應是引起心肌細胞凋亡的主要原因，血小板衍生因子（PDGF）具有刺激特定細胞群分裂增殖的能力，研究顯示PDGF水平與AMI患者預后相關(guān)[3]。前纖維蛋白-1（Profilin-1）具有調(diào)節(jié)氧化應激和血管內(nèi)皮細胞的功能，AMI患者血清Profilin-1水平顯著升高[4]。本研究主要探究左卡尼汀對磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）/Sirt1信號通路以及PDGF、Profilin-1表達的影響并探究其治療機理，為臨床更好的應用左卡尼汀治療AMI提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組45只成年雄性Wistar大鼠45只（Laboratory Animal Cecter，中國），體質(zhì)量250～280 g，隨機分為對照組（假手術(shù)組）、模型組和左卡尼汀組3組，每組各15只。

1.2 建模方法AMI模型參考董化江等[5]的方法，模型組和左卡尼汀組將大鼠使用水合氯醛（4%）麻醉后迅速打開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約 2 mm處的冠狀動脈前降支結(jié)扎，關(guān)閉并縫合。對照組常規(guī)打開并閉合胸腔，三組大鼠在建模后均腹腔注射青霉素[30萬單位/（kg·d）]預防感染，持續(xù)3 d。左卡尼汀組在術(shù)后腹腔注射左卡尼?。ㄥ\州九泰藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H20041552），劑量為40 mg/kg。注射等量的生理鹽水作為對照。常規(guī)飼養(yǎng)2周，收集尾靜脈全血，處死后收集心臟并于-80 ℃下保存。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）通過檢測大鼠

心肌酶指標判斷心肌梗死狀況，并檢測三組大鼠血清中PDGF、Profilin-1表達水平。將血液靜置后離心（2000 rpm，10 min），使用ELISA檢測大鼠血清樣本中肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶（CK-MB）、PDGF、Profilin-1的濃度。試劑盒購自華美公司（中國武漢）。根據(jù)說明書加入酶標記試劑和顯色劑，并通過加入終止溶液終止反應。使用酶標儀（Model 680，Bio-Rad，USA）測定450 nm處的光密度。

1.3.2 細胞活力及細胞凋亡檢測大鼠處死后收集心肌細胞，使用CCK-8法測定細胞活力，并使用流式細胞術(shù)用于檢測細胞凋亡。CCK-8試劑盒購自Tongren公司（日本），將心肌細胞處理后然后加入10 ml CCK-8試劑并在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)4 h。使用酶標儀（ELX 800，Bio-Teck，USA）測量每個孔在450 nm處的吸光度。凋亡試劑盒購自BD Pharmingen（USA），按照試劑盒說明書分別加入PE以及7-AAD，應用流式細胞儀（Becton Dickerson，SanJose，CA，USA）檢測和計算細胞凋亡率。

1.3.3 蛋白印跡（Western Blot）使用Western Blot檢測大鼠心肌組織中PI3K、Akt和Sirt1蛋白的表達水平。細胞裂解后收集總蛋白并檢測蛋白濃度，使用10%的SDS-PAGE凝膠并用于電泳，電泳后使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜（Bio-Rad，USA）并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育1.5～2 h，使用ECL試劑（Huiying，Shanghai，China）進行化學發(fā)光檢測。使用β-actin作為內(nèi)參。

1.3.4 實時熒光定量PCR（RT-PCR）將心肌組織研磨后使用RNA分離試劑盒分離RNA，然后通過RT-PCR反應檢測磷脂酰肌醇-3-羥基酶（PI3K）、蛋白激酶（Akt）和沉默調(diào)節(jié)蛋白A抗原（Sirt1）的mRNA表達水平。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，Japan）對RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄測定以合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為37℃，反應15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85℃，反應15 s；后進行RT-qPCR實驗，通過在95℃下激活DNA聚合酶5 min進行PCR，進行40個循環(huán)的兩步PCR（95℃/10 s和60℃/30 s），最終延伸75℃10 min，保持在4℃。所有引物均獲自Genewiz（中國江蘇蘇州）公司，使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差（SD）表示，使用單因素方差分析（ANOVA）評估實驗組間的差異，Speaman秩相關(guān)系數(shù)被應用于檢測相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組間心肌酶水平比較模型組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著高于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著低于模型組（P＜0.05）（表1）。

2.2 三組細胞活力和細胞凋亡情況比較模型組大鼠心肌細胞的細胞活力顯著低于對照組而凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠心肌細胞活力顯著高于模型組而凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）（表2）。

2.3 三組PDGF、Profilin-1水平比較模型組大鼠血清PDGF顯著低于對照組而Profilin-1水平顯著高于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠血清PDGF顯著高于模型組而Profilin-1水平顯著低于模型組（P＜0.05）（表3）。

2.4 組間PI3K/Akt/Sirt1信號通路表達水平比較模型組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著低于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著高于模型組（P＜0.05）（表4）。

表1 組間cTnT 和CK-MB水平比較

表2 三組細胞活力和細胞凋亡比較

表3 三組PDGF、Profilin-1水平比較

表4 三組大鼠PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平比較

3 討論

AMI是由于冠狀動脈急性引起的心肌梗死，具有發(fā)病急、進展快等特點，具有極高的病死率，且預后差異大，對患者生活和生命造成極大威脅[6]。近年來研究顯示左卡尼汀具有保護壞死心肌，減少缺血-再灌注對心肌的損傷的作用。PI3K/Akt是調(diào)節(jié)炎癥反應以及細胞凋亡的主要途徑，PI3K/Akt也具有調(diào)節(jié)AMI患者心肌細胞凋亡的作用[7]。

肌肉細胞是消耗能量較大的細胞，左卡尼汀可促進三羧酸循環(huán)正常進行從而生成細胞代謝或活動所需的能量，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性、節(jié)約代謝底物等方式降低耗氧量提高能量產(chǎn)生率，這會幫助降低活性氧自由基的水平，降低氧化應激水平和炎性水平，從而保護心肌細胞[8-11]。本次研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著高于對照組，左卡尼汀組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著低于模型組。模型組大鼠心肌細胞的細胞活力顯著低于對照組而凋亡率顯著高于對照組，左卡尼汀組大鼠心肌細胞活力顯著高于模型組而凋亡率顯著低于模型組。過往研究也顯示左卡尼汀可以保護心肌細胞，降低心肌酶譜cTnT和CK-MB的水平[12]。

Sirt1是PI3K/Akt的下游的蛋白，可往返于細胞質(zhì)和細胞核中，有研究發(fā)現(xiàn)硫化氫保護心肌細胞缺血-再灌注損傷的同時可以提高Sirt1的水平，PI3K/Akt/Sirt1信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡中起著重要作用[13]。PDGF有促進內(nèi)皮細胞或上皮細胞分裂的作用，從而促進細胞增殖[14]。本次研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清PDGF顯著低于對照組而Profilin-1水平顯著高于對照組，左卡尼汀組大鼠血清PDGF顯著高于模型組而Profilin-1水平顯著低于模型組。模型組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著低于對照組，左卡尼汀組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著高于模型組。過往研究顯示PDGF可通過促進PI3K/Akt通路的表達促進細胞增殖抑制細胞凋亡[15]。李曉娜等[16]研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PDGF可能通過下調(diào)PI3K/Akt通路減少膠原分泌、抑制表型轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗心肌纖維化作用。此外，PDGF還具有促進心血管生成的作用，從而改善心肌血流循環(huán)，改善缺氧狀況[17]。研究顯示高氧化應激水平會引起Profilin-1水平的升高，最新的研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠中Profilin-1的水平升高，并于促凋亡蛋白Bax的水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[18]。提示左卡尼汀可上調(diào)PDGF的水平，一方面上調(diào)PI3K/Akt/Sirt1通路的表達促進心肌細胞增殖并抑制器凋亡，另一方面，可促進血管生成改善氧化應激水平，使Profilin-1的水平下調(diào)[19,20]。

綜上所述，左卡尼汀具有促進PDGF和PI3K/Akt/Sirt1表達的作用，促進心肌增殖并抑制細胞凋亡，同時可改善氧化應激狀態(tài)使Profilin-1的水平下調(diào)，從而保護心肌細胞。