陳潛，王波，劉淦，盧瑩，周貝貝，曹玉祥，柳發(fā)虎，楊進孫，孫恩濤*

（1.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗學(xué)院，安徽 蕪湖241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗科；3.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院感染性疾病科）

瘧疾是重要的蚊媒傳染病。WHO數(shù)據(jù)顯示2017年在全球瘧疾病例中惡性瘧病例最多，且99.7%發(fā)生在非洲國家［1］。安徽省自2014年起，全省發(fā)現(xiàn)的瘧疾病例均為境外輸入性病例［2］。目前，以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)因其特異靈敏、準(zhǔn)確快速成為了實驗室診斷的首選方法［3］。治療瘧疾的藥物主要有氯喹、青蒿素、乙胺嘧啶等。氯喹作為一線抗瘧藥曾大面積使用甚至濫用，其耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重［4］。目前臨床治療瘧疾以青蒿素聯(lián)合療法為主，但近年來發(fā)現(xiàn)的惡性瘧原蟲對青蒿素的耐藥現(xiàn)象也受到了越來越廣泛的關(guān)注［5］。對于耐藥位點的檢測，Awasthi等［6］的研究結(jié)果表明只要氯喹耐藥基因—氯喹抗性轉(zhuǎn)運蛋白（P fcrt）發(fā)生錯義突變，惡性瘧原蟲即對氯喹耐藥。Takala-Harrison等［7］和Ariey等［8］的研究發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的青蒿素耐藥基因—K13發(fā)生突變即表現(xiàn)為青蒿素抗性。因此，早期確定瘧疾類型、及時檢測耐藥位點對有效控制瘧疾的流行、拯救患者生命至關(guān)重要。本研究采用巢式PCR檢測了皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院收住的1例輸入性重癥瘧疾患者的相關(guān)指標(biāo)，并對患者耐藥基因突變情況進行分析。

1 資料與方法

1.1 病例資料 患者，男，65歲，安徽省南陵縣人，工人，在非洲尼日利亞居住4月余。于2018年8月3日不慎摔倒后因出現(xiàn)意識模糊、大小便失禁遂被送往皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院就診，無肢體抽搐。實驗室檢查：白細(xì)胞9.8×109/L，中性粒細(xì)胞78.9%，紅細(xì)胞2.35×1012/L，血紅蛋白72 g/L，血小板22×109/L；瘧原蟲鏡檢：陽性；急診八項、胸部CT未見明顯異常。

1.2 研究方法

1.2.1 血涂片鏡檢 采集患者外周血制成厚、薄血涂片。干燥、固定后，用瑞氏染液染色，油鏡下觀察血涂片，并鑒定瘧原蟲種類。

1.2.2 瘧原蟲核酸檢測 采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取患者基因組DNA。參照文獻［9］的反應(yīng)程序和體系進行巢氏PCR擴增，引物序列見表1。引物序列的合成及擴增陽性片段測序工作均交由上海生工科技有限公司完成。

表1 惡性瘧巢式PCR引物序列

1.2.3 耐藥基因檢測 參照文獻［10］的方法擴增氯喹耐藥基因Pfcrt，文獻［11］的方法擴增青蒿素耐藥基因K13，耐藥基因巢式PCR引物序列見表2。引物序列的合成及擴增陽性片段測序工作均交由上海生工科技有限公司完成。

表2 耐藥基因巢式PCR引物序列

1.2.4 基因克隆測序分析 將2種耐藥基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進行克隆，陽性單克隆菌液送往上海生工科技有限公司測序，測序結(jié)果于NCBI上比對分析。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果 鏡下可見厚血膜中紅細(xì)胞堆疊，蟲體皺縮；薄血膜中被寄生的紅細(xì)胞形狀規(guī)則，大小正常或略縮小。瘧原蟲環(huán)狀體典型，較纖細(xì)，直徑約為紅細(xì)胞直徑的1/5，有的位于紅細(xì)胞邊緣，有的在環(huán)內(nèi)出現(xiàn)一個大的空泡。部分紅細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀體可見兩個細(xì)胞核，與惡性瘧原蟲形態(tài)相似，見圖1。

2.2 惡性瘧巢氏PCR擴增結(jié)果 取第2輪惡性瘧特異性PCR產(chǎn)物進行電泳，擴增條帶長度與目的條帶相近，約為200 bp，見圖2。

陽性產(chǎn)物測序結(jié)果通過NCBI上BLAST比對，相似率為100%，證實為惡性瘧原蟲，與形態(tài)鑒定一致。

2.3 耐藥基因擴增結(jié)果 取氯喹耐藥基因Pfcrt巢式PCR第二輪產(chǎn)物進行電泳，擴增條帶長度與目的條帶相近，約為140 bp；青蒿素耐藥基因K13巢式PCR第二輪產(chǎn)物進行電泳，擴增條帶長度與目的條帶相近，約為750 bp。見圖3。

圖1 血涂片鏡檢結(jié)果（瑞氏染色×1 000）

圖2 惡性瘧巢式PCR檢測結(jié)果

圖3 耐藥基因巢式PCR檢測結(jié)果

上述兩種陽性產(chǎn)物經(jīng)克隆測序結(jié)果通過NCBI上BLAST比對，相似率為100%，證實Pf crt基因和K13基因均未發(fā)生突變。

3 討論

近年來，隨著全球人口流動和貿(mào)易往來的不斷加快和深入，往返非洲和東南亞等瘧疾高發(fā)地區(qū)的人員越來越多，如何有效防治輸入性瘧疾感染是當(dāng)今面臨的新問題。《2018年世界瘧疾報告》指出，在全球所有瘧疾病例中，尼日利亞、剛果、莫桑比克、印度、烏干達等5個國家占近一半，其中以尼日利亞（25%）最多［1］。我國近年來感染的輸入性瘧疾病例主要為惡性瘧和間日瘧［12-13］。本研究患者即為尼日利亞輸入性惡性瘧感染。安徽省作為勞務(wù)輸出大省，則更應(yīng)該重視輸入性瘧疾的診斷和控制。

本例患者外周血涂片中未發(fā)現(xiàn)配子體，這與惡性瘧外周血中少見配子體相一致［14］。瘧原蟲環(huán)狀體纖細(xì)，約為紅細(xì)胞直徑的1/5；胞內(nèi)可含2個以上原蟲，蟲體位于紅細(xì)胞邊緣，符合惡性瘧原蟲的特征。鏡檢雖然作為瘧原蟲診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其操作過程較長，受采血時間、制片染色等人為因素影響較大，在瘧原蟲密度較低時可能漏檢［15］，導(dǎo)致報告結(jié)果呈假陰性［16］。而且，血涂片鏡檢在卵形瘧、三日瘧和混合感染的診斷時準(zhǔn)確率較低［17-18］?？焖贆z測試劑條（rapid diagnostic test，RDT）檢測方法的準(zhǔn)確性、特異性均較高，可大范圍篩查，簡便快捷，經(jīng)濟投入也較少，但是其對瘧原蟲分型準(zhǔn)確度欠缺，結(jié)果可信度一般，還需要其他方法的進一步驗證，只適合定性篩查，不適合定型，偶見假陰性［19］。因此，及時敏感的診斷方法對臨床患者的治療至關(guān)重要。有研究表明，PCR技術(shù)在瘧原蟲密度低至0.2個/μl以下時即可檢測，而且在鑒別蟲種和混合感染時也有顯著效果［20］。周水茂等［21］研究也表明巢式PCR在診斷輸入性瘧疾病例時效果良好。本研究采用的方法即為巢式PCR，兩輪擴增使產(chǎn)物更精確，減少非特異性擴增的影響。該法敏感性和特異性均較高，在一般實驗室即可開展，但為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性，可以聯(lián)合鏡檢和PCR兩種方法進行檢測。

雖然瘧疾的控制取得了顯著的成效，但隨之出現(xiàn)的耐藥突變也不容忽視。研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲對目前所有已知的單一抗瘧藥都產(chǎn)生了耐藥性［22］，WHO也強調(diào)了聯(lián)合用藥在瘧疾治療中的重要性。因此，本研究檢測了臨床上最主要的抗瘧藥氯喹和青蒿素的耐藥情況。Dittrich等［23］研究表明一旦Pfcrt基因exon2區(qū)72～76連鎖的5個編碼氨基酸其中一個發(fā)生錯義突變，惡性瘧原蟲即對氯喹產(chǎn)生耐藥性。同時，研究結(jié)果也表明，K13基因的突變與蟲株對青蒿素產(chǎn)生抗性密切相關(guān)，該分子作為青蒿素抗性相關(guān)的分子標(biāo)記已被廣泛接受［24-26］。雖然本例患者氯喹耐藥基因P fcrt和青蒿素耐藥基因K13均未發(fā)生突變，但檢測的重要性卻不容忽視。通過對這些輸入性惡性瘧原蟲相關(guān)基因的檢測，可以早期預(yù)測瘧原蟲是否產(chǎn)生耐藥突變，從而指導(dǎo)臨床及時調(diào)整用藥方案，延長抗瘧藥的使用期限，提高抗瘧藥的治療效果，這對我國2020年全國消除瘧疾目標(biāo)的實現(xiàn)具有重要意義。