孟 永，盧國華，謝 陽，孫新成，黃麗琴

0引言

Peters異常(Peters’ anomaly，PA)是較少見的眼前段發(fā)育不良性眼病，1906年由Peters首先報道，臨床表現(xiàn)為先天性的角膜中央?yún)^(qū)混濁，對應區(qū)域的角膜后基質(zhì)層變薄和后彈力層缺損、虹膜角膜粘連等[1]。該病在新生兒中的發(fā)病率國外報道為1.2/100000，絕大部分病例為散發(fā)，但也有一些常染色體顯性及隱性遺傳的報道[2-3]。Peters異常分型：按照文獻描述的方法可將Peters異常分為Ⅰ型和Ⅱ型，僅有角膜混濁、虹膜前粘連而無晶狀體異常者為I型，同時合并白內(nèi)障或存在晶狀體與角膜內(nèi)皮粘連者為Ⅱ型，如果還伴有神經(jīng)起源的全身異常則診斷為Peters綜合征。臨床中Peters異常患者可合并有其它眼部非特征性異常如鞏膜化角膜、牽?；ňC合征、Axenfeld-Rieger綜合征(Axenfeld-Rieger syndrome，ARS)、永存原始玻璃體增生癥(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)等[4-5]。目前國外有Peters異常相關致病基因PITX2、PAX6等的分子遺傳學的研究；而國內(nèi)Peters異常PITX2和PAX6基因的報道很少[6-7]。PITX2是Paired-Bicoied同型盒蛋白家族成員,剪切翻譯形成271aa，317aa，324aa三種亞型，這三種亞型同源結(jié)構(gòu)域以及羧基端的序列相同，而氨基端不同，第60位的氨基酸同源結(jié)構(gòu)域2(homeobox-2)可通過其內(nèi)在的“螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋”(helix-turn-helix，HTH)結(jié)構(gòu)與特異性DNA位點相結(jié)合，在發(fā)育中起著重大作用，第50位同源結(jié)構(gòu)域氨基酸賴氨酸對于特異性結(jié)合DNA具有決定性作用；PAX6是眼球發(fā)育的主控基因之一，其編碼產(chǎn)物是結(jié)合蛋白家族之一,其中的配對盒結(jié)構(gòu)域和同源結(jié)構(gòu)域作為高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，可通過結(jié)合特定序列在視網(wǎng)膜、晶狀體和角膜中廣泛表達。在中國人群中進行該項研究，既可以了解中國人群Peters異常患者中PITX2和PAX6基因的突變情況，分析中國人群中Peters異?；蛐捅硇偷年P系，為進一步研究其發(fā)病機制提供線索。

1對象和方法

1.1對象對2016-01-01/2019-03-30于常州市第二人民醫(yī)院和第三人民醫(yī)院就診的15例Peters異常患者的臨床資料進行分析，詳細詢問病史和家族史并進行PITX2和PAX6基因篩查；對發(fā)現(xiàn)的突變患者其家系成員均完善眼科檢查，并排除全身的異常，收集臨床的資料。80例正常對照者均無眼或全身遺傳性疾病，和患者無任何血緣關系。遵循相關倫理原則,征得患者及所有成員的同意后抽血制備基因組DNA,并收集相關臨床資料。

1.2方法

1.2.1聚合酶鏈反應(PCR)擴增采集Peters異?；颊吆退谐蓡T外周血DNA，引物序列及擴增條件見本文作者之前發(fā)表Peters異常一文[6]。

圖1正常對照者及突變患者測序圖A：正常對照者；B：突變患者。

圖2異源雙鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析結(jié)果+：突變患者。

1.2.2突變基因篩查PCR產(chǎn)物純化以后，加入BigDye雙向測序反應，使用AB13730分析儀雙向測序，測序發(fā)現(xiàn)的PITX2和PAX6新突變結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中PITX2及PAX6的序列進行比對，確定突變位點。根據(jù)人類基因組變異協(xié)會(HGVS，http://www.hgvs.org/)命名法對PITX2和PAX6突變進行命名。

1.2.3測序結(jié)果分析將堿基變異的測序結(jié)果輸入DNAStar公司的MapDraw程序進行遺傳信息改變的確定，NCBI上人類基因組數(shù)據(jù)庫中,PITX2及PAX6兩個基因的DNA序列作為標準序列，以識別堿基變異對氨基酸編碼產(chǎn)生的影響。

1.2.4異源雙鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析用異源雙鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(HA-SSCP)的方法對突變患者及其父母及80例正常對照進行對比驗證。

2結(jié)果

對15例Peters異?；颊逷ITX2和PAX6基因的外顯子及鄰近的內(nèi)含子區(qū)域進行直接測序，15例Peters異?；颊逷AX6基因未能發(fā)現(xiàn)任何突變，患者中檢測到1個已報道PITX2缺失突變c.296delG(P.R99fsx56)，正常對照者及突變患者測序圖對照(圖1)。分析其詳細臨床資料，這是中國首次報道伴有ARS的Peters異常眼病PITX2基因突變。

2.1基因突變篩查Peters異常1例及ARS合并癥患者中發(fā)現(xiàn)一PITX2基因突變，該突變?yōu)槿笔蛔?，位于PITX2A的第五外顯子內(nèi)，編碼區(qū)第296位的堿基G缺失，該堿基缺失的后果會導致羧基端讀碼框架的移位，使編碼的第98位氨基酸和原蛋白發(fā)生偏離，并且移位的讀碼框架在編碼第153個氨基酸后產(chǎn)生了一個提前的終止密碼子，致使理論上不能繼續(xù)編碼蛋白，致使PITX2羧基端丟失。

2.2異源雙鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析結(jié)果異源雙鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性的方法對直接測序結(jié)果做了進一步證實，結(jié)果示該患者條帶不同于正常對照者(圖2)，該患者家系中的表型正常的患者父母及80例正常對照者中均未發(fā)現(xiàn)同樣突變，證明該患者的PITX2基因的突變存在。

圖3突變患者雙眼眼前節(jié)照相A：右眼；B：左眼。

圖4圖3同患者術后6mo雙眼眼底照相A：右眼：未見明顯異常；B：左眼：黃斑區(qū)發(fā)育不良。

2.3 PITX2突變患者病例資料PITX2突變患者，男，45歲，因“雙眼視物不見40余年”來我院門診求進一步診治(雙眼眼前節(jié)照相見圖3)。既往史：患者訴自出生被發(fā)現(xiàn)左眼發(fā)白，否認吸氧史、家族遺傳病史以及外傷史。眼科檢查：雙眼水平性眼球震顫，視力右眼為0.3，左眼為光感，眼壓：右眼19mmHg，左眼18mmHg。A超掃描眼軸右眼為26.00mm，左眼為27.00mm，由于雙眼的眼球震顫明顯，雙眼驗光：測不出?；颊哂已劢悄ね该?，虹膜發(fā)育不全虹膜萎縮裂孔形成，周邊虹膜與角膜粘連，典型的改變是粗大的線樣條帶自虹膜周邊部跨越房角附于Schwalbe線上，晶狀體略混濁，眼底未見明顯異常；左眼角膜中央混濁，直徑5mm×5mm，白色混濁區(qū)的角膜后部基質(zhì)變薄和后彈力層缺損，虹膜角膜粘連，周邊角膜血管化，余眼內(nèi)結(jié)構(gòu)不清?；颊呒凹覍僖笮凶笱凼中g治療，向患者詳細介紹了左眼的自然病程、手術風險及并發(fā)癥后，最后行左眼穿透性角膜成形術，術中見虹膜角膜黏連，瞳孔大小約2mm，白內(nèi)障形成，隨術中予以聯(lián)合白內(nèi)障摘除+眼前段玻璃體切除術，術后視力無明顯提高。術后6mo患者復查，左眼角膜植片透明，眼底可見黃斑區(qū)發(fā)育不良(圖4)。臨床診斷：右眼ARS，左眼Peters異常Ⅱ型。

3討論

眼前段發(fā)育不良(anterior segment dysgenesis,ASD)是一系列眼前段組織結(jié)構(gòu)形態(tài)異常疾病的總稱，可分為不同的亞型：ARS、PA、無虹膜等，這些亞型被認為是由神經(jīng)嵴細胞的異常遷移引起的，它是受局部因素、受體、感應器以及視杯和眼周間質(zhì)等組織之間的信號相互作用的共同結(jié)果[8]。Peters異常和Axenfeld-Rieger綜合征均可引起眼前段組織結(jié)構(gòu)形態(tài)異常，患者常因眼壓升高引起青光眼，最終導致視力嚴重障礙，是致盲性眼病。在本研究中，我們對2016-01-01/2019-03-30于常州市第二人民醫(yī)院和第三人民醫(yī)院就診的15例Peters異?；颊哌M行PITX2及PAX6基因突變分析，發(fā)現(xiàn)1例新的突變，并分析臨床表型，該患者雙眼分別表現(xiàn)為ARS和Peters異常兩種罕見的眼前段異常表型，且左眼眼底合并嚴重黃斑部發(fā)育不良；并且回顧性分析比較國內(nèi)已報道的Peters異?；颊逷ITX2及PAX6基因突變以及相關表型。

3.1 Peters異常與ARS臨床特點Peters異常是先天性角膜混濁白斑中最常見的一種眼病，國外報道的新生兒發(fā)病率為1.2/100000，主要為散發(fā)病例，亦有常染色體顯性及隱性遺傳的報道。Peters異常同時合并白內(nèi)障或存在晶狀體與角膜內(nèi)皮粘連者為Ⅱ型。ARS是臨床中少見病，患者可雙眼發(fā)病，發(fā)病率約為1/200000，典型的特點為周邊部角膜增厚突起和前移的Schwalbe線(角膜后胚胎環(huán))，虹膜的發(fā)育異常為：虹膜變薄裂孔或多瞳形成，瞳孔異位變形，葡萄膜外翻；ARS患者可有全身的異常如面額部的發(fā)育異常、牙齒發(fā)育不良，臍周贅皮等。兩種疾病眼壓升高導致的青光眼發(fā)病率約為50%。本研究中的該突變患者臨床特點：(1)雙眼先天起病，水平眼球震顫，斜視；(2)患者右眼角膜透明，虹膜發(fā)育不全虹膜萎縮裂孔形成，周邊虹膜與角膜粘連，可見角膜后胚胎環(huán)；(3)左眼角膜中央混濁，直徑5mm×5mm，白色混濁后方的基質(zhì)變薄和后彈力層缺損，中央虹膜角膜粘連，合并白內(nèi)障；以上臨床特點符合右眼ARS和左眼Peters異常Ⅱ型的臨床診斷。

3.2 Peters異?；蛐?表型的關系已報道的PITX2基因突變大多導致Axenfeld-Rieger綜合征，1977年Awan[9]首次將一患者右眼ARS和左眼Peter異常合并為Peters-Rieger綜合征，同時也提到了Peters-Rieger綜合征的復雜性眼部和全身異常，但未進行相關基因分析；1999年W-Doward第一個報道PITX2突變可引起Peters異常，2000年Perveen等發(fā)現(xiàn)PITX2基因突變導致一患者左右眼Axenfeld-Rieger綜合征和Peters異常兩種眼病[10-11]，這似乎意味著兩者眼病發(fā)病原因間某種共同聯(lián)系。W-Doward等報道1例PITX2基因第3內(nèi)含子位點A～T突變引起Peter異常，而對側(cè)眼有白內(nèi)障和虹膜發(fā)育不良，并有牙齒和臍帶異常，另有輕度左房發(fā)育不全病例，在1999年的功能分析中表明，被診斷為Peters異常合并Axenfeld-Rieger綜合征。神經(jīng)嵴細胞紊亂也影響身體的其他部分，除典型的全身表現(xiàn)外，還報告了其他不尋常的眼部異常。Bhate等[12]和Park等[13]分別報告了2例ARS患者眼外肌發(fā)育不全引起的斜視。眼外肌起源于中胚層，神經(jīng)嵴細胞起源的中胚層的發(fā)育障礙可能解釋了眼外肌的臨床表現(xiàn)。

2010年賈秀華等報道了1例10月齡的中國男嬰PAX6的新突變P.Asn17Lys，該突變患者具有Peters異常臨床特征，先證者雙眼均有小角膜、小眼球、眼球震顫、先天性角膜白斑、虹膜發(fā)育不良和前極部白內(nèi)障，B超檢查眼部表現(xiàn)為玻璃體和視神經(jīng)結(jié)構(gòu)異常，對患者進行了PITX2和FOXC1基因突變篩查，但均未發(fā)現(xiàn)突變[7]。2011年Zhang等[14]報道了中國人群中PAX6基因同一突變導致家系中不同患者眼部表型不同的病例。2016年黃麗琴等[6]報道1例Peters綜合征患者P.Arg69His突變，而國外文獻報道的該突變導致Axenfeld-Rieger綜合征,該突變可導致PPS和ARS兩種不同的眼前段發(fā)育不良臨床表型。PA以及ARS均是臨床少見病。Peters異常與ARS通常被認為眼前段發(fā)育不良的兩種眼病，而臨床中Peters異?；颊呖珊喜⒂衅渌鄄慨惓＃喊ㄐ〗悄?、白內(nèi)障、永存原始玻璃體增生癥等，目前國外Peters異常合并ARS的PITX2的研究也僅有2篇，在本研究中，我們對15例Peters異?；颊哌M行了PITX2基因和PAX6基因突變的篩查，PAX6基因未能發(fā)現(xiàn)突變，PITX2檢測到了1種新的框移突變c.296delG(P.R99fsx56)，該例患者右眼ARS合并左眼Peters異常。

PITX2基因突變可引起同一患者ARS合并Peters異常表型，國外亦有FOXC1突變引起患者ARS合并Peters異常表型。2002年，Honkanen等[15]首次報道了由FOXC1基因點突變(Phe112Ser)引起的ARS和PA雙眼異常，患者無全身異常，視神經(jīng)正常，眼壓正常，無青光眼發(fā)生。Berry等[16]已經(jīng)證明FOXC1和PITX2相互作用的，并推測這種相互作用在胚胎發(fā)生過程中神經(jīng)嵴細胞的正確遷移分化必不可少，從而促進眼前段正常發(fā)育，從而解釋了兩基因突變能產(chǎn)生相同的表型原因。PITX2屬于Paired-Bicoied同型盒蛋白家族,60個氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)2可由其內(nèi)部的“螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋”結(jié)構(gòu)與特異性的DNA位點相結(jié)合，在個體發(fā)育中起重要作用。PITX2基因在視網(wǎng)膜以及晶狀體中無正常表達，但該研究中的患者眼底合并有黃斑發(fā)育不良，PAX6編碼產(chǎn)物屬于結(jié)合蛋白家族,同源結(jié)構(gòu)域識別、結(jié)合特定序列而調(diào)節(jié)其靶基因的表達，已有研究表明該基因與角膜、虹膜、晶狀體形成后期、神經(jīng)視網(wǎng)膜形成密切相關，PAX6是同步不同來源的細胞間復雜相互作用的關鍵因素，而這些細胞類型都是適當?shù)那昂笱坌螒B(tài)發(fā)生所必需的。但在本研究中患者PAX6基因的篩選陰性，對于該患者發(fā)生嚴重眼底黃斑發(fā)育不良的原因，有一些可能的解釋：(1)可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的修飾基因突變或其他一些影響表型的基因；(2)下游靶基因或輔助因子基因的特定等位基因可能與患者廣泛的眼病有關。

在本研究中，我們對中國人群中的15例Peters異常患者進行PITX2及PAX6基因突變的篩查，并分析比較國內(nèi)已報道的Peters異常PITX2及PAX6基因突變。這是目前國內(nèi)第一個報道Peters異常合并ARS眼病PITX2基因突變c.296delG(P.R99fsx56)，結(jié)果豐富了PITX2基因突變頻譜，并研究其相關表型，有助于進一步了解該復雜疾病，闡明其可能發(fā)病的分子遺傳學病因，希望這方面的進一步研究能為Peter異常和Axenfeld-Rieger綜合征的確切機制提供依據(jù)；本研究更進一步提醒我們臨床眼科醫(yī)師，對于先天性角膜混濁病例，應該結(jié)合眼前段及眼后段共同分析的重要性，對Peters異?；颊叩氖中g效果提供有價值的信息。由于Peters異常與ARS是臨床少見病，Peters異常合并ARS眼病臨床中更是少見，本研究中由于樣本量少，因此PITX2和PAX6基因與該Peters異常的關系還有待進一步研究。