王會征　蘭玉彬

摘要：葡聚糖酶抑制蛋白（GIP）是辣椒疫霉菌在病理環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白，是病原菌抗性蛋白的一種。本研究根據(jù)辣椒疫霉菌全基因組序列，通過生物信息學(xué)分析、序列比對獲得葡聚糖酶抑制蛋白全長基因序列。以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因組為模板擴(kuò)增GIP基因cDNA，并對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析?；蚪?jīng)測序驗(yàn)證后與載體pET28a（+）連接，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli Rosetta），用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白6×His-GIP。重組蛋白在5 mol/L尿素變性環(huán)境下進(jìn)行親和層析純化，對純蛋白進(jìn)行透析、復(fù)性、濃縮后進(jìn)行分子排阻層析純化，并對獲得的純蛋白進(jìn)行蛋白結(jié)晶試驗(yàn)，為進(jìn)一步闡明GIP作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒疫霉菌;葡聚糖酶抑制蛋白（GIP）;原核表達(dá);純化;結(jié)晶

中圖分類號：S432.4+4：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2019）10-0111-06

Prokaryotic Expression， Purification and Crystallization of Glucanase

Inhibitor Protein （GIP） from Phytophthora capsica

Wang Huizheng， Lan Yubin

（College of Agricultural Engineering and Food Science， Shandong University of Technology/National Sub-center

for International Collaboration Research on Precision Agricultural Aviation Pesticide Spraying Technology， Zibo 255000， China）

Abstract Glucanase inhibitory protein （GIP） is a kind of resistant protein induced by Phytophthora capsici in pathological environment. Based on the whole-genome sequence data of P. capsici， a full-length gene sequence of GIP was obtained by bioinformatics analysis and sequence alignment. The whole genome of highly pathogenic strain P. capsici SD33 was extracted and used as temple for polymerase chain reaction to amplify cDNA of the GIP gene， and related bioinformatics analysis was performed. The gene was verified by sequencing and ligated with the vector pET28a（+）， and the constructed recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta to express the recombinant protein 6×His-GIP by IPTG induction. The recombinant protein was purified by affinity chromatography in 5 mol/L urea denaturing environment. The purified protein was dialyzed， renatured and concentrated， and then subjected to molecular exclusion chromatography purification. The crystallization experiment using pure protein was carried out， which could provid a basis for clarifying the mechanism of GIP.

Keywords Phytophthora capsici; Glucanase inhibitor protein（GIP）; Prokaryotic expression; Purification; Crystallization

從病原菌接觸植物到寄主發(fā)病，是病原菌解除寄主防御及寄主抵抗病原菌入侵和繁殖相互斗爭和協(xié)同進(jìn)化的過程，包含各種信號的傳遞和寄主在細(xì)胞、組織、形態(tài)、生理、生化及分子等水平下復(fù)雜的變化過程。研究表明病原菌與寄主互作過程中分泌的細(xì)胞壁降解酶等致病酶和致病酶抑制蛋白產(chǎn)生于整個(gè)侵染過程中[1，2]。

在受到病原微生物侵染時(shí)，寄主植物分泌內(nèi)切-β-1， 3-葡聚糖酶，以分解來自于真菌和卵菌等病原物細(xì)胞壁的β-1， 3-葡聚糖聚合物，是寄主防衛(wèi)機(jī)制的一種[3，4]。面對內(nèi)切-β-1， 3-葡聚糖酶的攻擊，疫霉菌等卵菌通過分泌葡聚糖酶抑制蛋白（glucanase inhibitor protein， GIP）表現(xiàn)出抗性[5]。相對于病原物在與寄主互作過程中分泌的葡聚糖酶抑制蛋白，研究更多的是寄主植物產(chǎn)生的β-1， 3-葡聚糖酶[6-8]，它通過降解病原物的細(xì)胞壁，產(chǎn)生寡聚糖和寡糖激發(fā)子，進(jìn)而增強(qiáng)寄主植物的抗病性[9]。

近年來研究較多的是疫霉屬等卵菌病原物中的GIP，如對樟疫霉GIP序列的擴(kuò)增及不同侵染期表達(dá)量的差異性研究等[10]?；蜣D(zhuǎn)錄、翻譯形成的蛋白空間結(jié)構(gòu)是功能基因編碼的蛋白質(zhì)行使生物功能的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)各種功能特性均受其空間結(jié)構(gòu)的調(diào)控，不同功能基因均編碼特異空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，由此決定了生命現(xiàn)象的多樣性。因此立足蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，更易于探明特異功能基因遺傳本質(zhì)與調(diào)控機(jī)理。對GIP蛋白結(jié)構(gòu)的研究最早在致病疫霉上[11]，從GIP三維結(jié)構(gòu)上闡明了不同基因作用模式的不同。對畢赤酵母GIP結(jié)構(gòu)的研究闡明了其活性喪失的三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)特征[12]。

對辣椒疫霉菌GIP的研究相對較少，尤其是通過蛋白純化、晶體生長進(jìn)而解析其三維結(jié)構(gòu)的研究目前還未見報(bào)道[13]。本研究通過原核表達(dá)獲得辣椒疫霉菌GIP純蛋白，進(jìn)而嘗試進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶，以期獲得蛋白晶體進(jìn)而解析其三維結(jié)構(gòu)，為研究辣椒疫霉菌GIP作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒疫霉菌高致病性菌株SD33，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌及真菌資源利用研究室分離獲得并保存;表達(dá)載體pET28a（+）（Novagen公司）;大腸桿菌菌株（Escherichia coli） BL21 （DE3）、E. coli Rosetta、pEASY-T3載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ等，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4 DNA連接酶、rTaq酶、dNTP、卡那霉素、DNA Marker、蛋白Marker等，購自寶生物工程（大連）有限公司;Tris、NaCl、咪唑等蛋白純化及晶體生長所需超純生化試劑，購自上海Sigma公司; IPTG、SDS、乙醇、鹽酸等其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 基因GIP的生物信息學(xué)分析

通過比對、分析辣椒疫霉菌基因組（JGI： http：//genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.home.html）全序列信息獲得葡聚糖酶抑制蛋白基因GIP序列信息，利用https：//web.expasy.org/protparam/在線分析GIP基因編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn)等;蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析和信號肽分析分別利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）在線軟件進(jìn)行分析;利用Protean軟件對GIP二級結(jié)構(gòu)組成、親疏水性等性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測及分析。

1.3 基因克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過獲得的葡聚糖酶抑制蛋白基因GIP核苷酸序列信息設(shè)計(jì)引物，正向引物為GIP-F：5′- CGCGGATCCGAACACGTTGAACGTCAGCTT-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物為GIP-F：5′- CCGGAATTCTTATTTCGTGACGGAGTTGAT -3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。基因克隆載體為pEASY-T3載體，原核表達(dá)載體為pET28a（+），以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因組為模板擴(kuò)增GIP基因的cDNA，基因克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建具體步驟參照文獻(xiàn)[14]。

1.4 重組質(zhì)粒pET28a/GIP的鑒定及誘導(dǎo)表達(dá)

采用PCR擴(kuò)增、酶切驗(yàn)證篩選陽性克隆重組質(zhì)粒pET28a/GIP，由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序驗(yàn)證后的陽性克隆提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta菌株，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落用5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.4～0.6。菌液分別加入終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，于16℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況，確定最佳誘導(dǎo)條件并進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白6×His-GIP，收集菌液備用。

1.5 重組蛋白6×His-GIP的純化

在普通重懸緩沖液A（20 mmol/L Tris，pH 8.5;150 mmol/L NaCl）并添加一定的超聲輔助緩沖液B[10%（V/V）甘油，5 mmol/L β-巰基乙醇，0.5%（V/V）Tween-20]下重組蛋白為包涵體，更換含有尿素的緩沖液C（緩沖液A+5 mol/L尿素）重懸沉淀即可使沉淀溶解，4℃、15 000 r/min離心30 min，取上清按照Ni-NTA蛋白純化試劑盒操作說明對重組蛋白6×His-GIP進(jìn)行純化。其中洗雜液為緩沖液D（緩沖液C+20 mmol/L咪唑），洗雜500 mL左右;洗脫液為緩沖液E（緩沖液C+500 mmol/L咪唑），洗脫20 mL左右;對洗脫液進(jìn)行低溫過夜透析，透析液分別為緩沖液A+3 mol/L尿素、緩沖液A+1 mol/L尿素、緩沖液A，直至除去尿素，對重組純蛋白進(jìn)行復(fù)性。

對親和層析純化后復(fù)性純蛋白進(jìn)行分子排阻層析純化，純化所用緩沖液為緩沖液A+5 mmol/L DTT，所用層析柱為Superdex-75。

1.6 重組蛋白6×His-GIP的結(jié)晶

對層析純化后的重組蛋白6×His-GIP采用氣相擴(kuò)散、坐滴法進(jìn)行蛋白結(jié)晶嘗試，選用Hampton Research試劑盒Crystal ScreenⅠ和Ⅱ、PEG/Ion ScreenTM、Salt RxTM1等進(jìn)行晶體生長條件初篩，蛋白濃度選用2、5、10 mg/mL，溫度選用20℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 GIP的理化性質(zhì)及生物信息學(xué)分析

辣椒疫霉菌葡聚糖酶抑制蛋白基因GIP序列全長為777 bp，最大開放閱讀框 （ORF） 長774 bp，ORF編碼一個(gè)含258個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測編碼產(chǎn)物大小約為24.7 kD，無跨膜區(qū)，信號肽含有20個(gè)氨基酸殘基，5個(gè)半胱氨酸，等電點(diǎn)為4.85?；纠砘再|(zhì)見表1。

對GIP的二級結(jié)構(gòu)組成、親疏水性等性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測與分析。由圖1可知，組成GIP的二級結(jié)構(gòu)主要為β折疊，α螺旋和不規(guī)則卷曲較少;疏水性區(qū)域相對較多，這和后續(xù)蛋白純化過程中GIP較難溶相吻合。

2.2 GIP基因cDNA的PCR擴(kuò)增

GIP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得與預(yù)期結(jié)果一致的條帶（圖2），大小約777 bp。擴(kuò)增基因測序結(jié)果與公布的辣椒疫霉菌全基因組GIP基因比對，發(fā)現(xiàn)存在12個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，翻譯成氨基酸后的序列存在3個(gè)位點(diǎn)的差異，可能是由于菌株小種?；筒煌斐傻?。

2.3 GIP基因cDNA的原核表達(dá)

將測序驗(yàn)證后的GIP基因cDNA與表達(dá)載體pET28a（+）連接轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta表達(dá)菌株，菌液經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)，以空載體原核表達(dá)產(chǎn)物為陰性對照，通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白6×His-GIP表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在28 kD左右出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶（圖3），不同IPTG濃度對重組蛋白表達(dá)量影響不大。最終確定誘導(dǎo)條件為0.1 mmol/L的IPTG 16℃下誘導(dǎo)20 h左右收集菌液，1 L菌液中大約收集3 g的菌體。

2.4 重組蛋白6×His-GIP的純化及復(fù)性

重組蛋白在普通緩沖液A或添加增溶劑B下均以包涵體的形式存在，在緩沖液中添加尿素至5 mol/L時(shí)目標(biāo)蛋白溶解，因重組蛋白含有His標(biāo)簽，所以使用Ni柱進(jìn)行親和層析純化。蛋白經(jīng)掛柱、洗雜、洗脫后以單一條帶出現(xiàn)在SDS-PAGE蛋白凝膠上（圖4）。掛柱后的流穿液仍有較多重組蛋白，可能與Ni柱的有效載量或變性后的蛋白親和層析特異性較低、相對容易被洗雜液洗脫下來等因素有關(guān)。

對洗脫蛋白采取低溫過夜透析、逐漸降低尿素濃度的方法進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性后的重組蛋白6×His-GIP以可溶形式存在于普通緩沖液A中，利于下游試驗(yàn)，但蛋白濃度有所下降（圖4），即目標(biāo)蛋白在復(fù)性過程中有所損失，部分蛋白復(fù)性未成功而形成沉淀。對親和層析純化后復(fù)性純蛋白濃縮后進(jìn)行分子排阻層析純化，并對單一峰值下的蛋白進(jìn)行收集并濃縮以進(jìn)行下游結(jié)晶試驗(yàn)。分子排阻層析純化后的重組蛋白6×His-GIP為單一峰，但對峰值下的蛋白收集濃縮后經(jīng)SDS-PAGE分析出現(xiàn)緊鄰的兩條條帶（圖5），此蛋白在高濃度下可能發(fā)生了寡聚化作用或生成了二硫鍵。

2.5 純蛋白6×His-GIP的結(jié)晶

對純蛋白6×His-GIP進(jìn)行酶活性測定（相關(guān)結(jié)果另文發(fā)表），顯示純蛋白6×His-GIP具有活性。對蛋白進(jìn)行結(jié)晶嘗試，發(fā)現(xiàn)形成了一定大小的晶核（圖6），但至今未生長出質(zhì)量較好的蛋白晶體，目前正在繼續(xù)優(yōu)化結(jié)晶條件。

3 討論與結(jié)論

葡聚糖酶抑制蛋白GIP是與病程相關(guān)蛋白類似的一種抗性蛋白，研究較多的是存在于寄主植物上且能引發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的GIP分泌蛋白[3，4]，而產(chǎn)生于病原菌的GIP與寄主植物的區(qū)別在于此蛋白為病原菌本身在病理或病理相關(guān)環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白，是病原菌對寄主植物抗性反應(yīng)表現(xiàn)出來的自身抗性反應(yīng)。

2008年辣椒疫霉菌全基因組序列草圖由美國能源部基因研究所公布于眾（http：//genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.home.html）并不斷更新完善。通過生物信息學(xué)分析，越來越多人們感興趣的基因被發(fā)現(xiàn)進(jìn)而為揭示其相關(guān)功能并被人們利用提供了便利。通過生物信息學(xué)分析我們首次從高致病性辣椒疫霉菌菌株SD33上克隆到GIP基因，與公布的基因組序列存在微小差異，可能是因?yàn)闇y序菌株與本試驗(yàn)所用菌株小種?；偷牟煌斐傻模⒉挥绊懟虻墓δ芴匦?。

近年來，借助基因組學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)，開展了系列植物病原菌致病因子功能特性及其致病機(jī)制研究，取得了若干有價(jià)值的研究結(jié)果，但對病原菌抗病因子的研究資料匱乏。本研究選取抗病因子GIP為研究對象，試圖解析其三維結(jié)構(gòu)即從原子水平探明其遺傳本質(zhì)與調(diào)控機(jī)理，其基礎(chǔ)就在于獲得GIP純蛋白并生長出蛋白晶體。

本研究利用pET系統(tǒng)構(gòu)建了GIP原核表達(dá)體系，在試用E. coli BL21 （DE3）菌株未表達(dá)出重組蛋白時(shí)改用E. coli Rosetta菌株成功表達(dá)出目的蛋白，為表達(dá)真核基因尤其是含稀有密碼子的基因提供了借鑒。對表達(dá)出的重組蛋白采用低濃度誘導(dǎo)劑、低溫長時(shí)間誘導(dǎo)的策略使重組蛋白充分折疊以免形成包涵體，但表達(dá)出的重組蛋白6×His-GIP在普通緩沖液或添加增溶劑下均以包涵體的形式存在。綜合考慮蛋白回收率及后期蛋白復(fù)性、結(jié)晶等因素，我們選擇在5 mol/L尿素濃度下進(jìn)行純化及復(fù)性，并通過分子排阻層析進(jìn)行再純化，但濃縮后的蛋白可能發(fā)生了寡聚化作用或生成了二硫鍵，即蛋白的均一性不夠高，這也是在后續(xù)結(jié)晶試驗(yàn)時(shí)只能形成晶核但未成功培養(yǎng)出較好晶體的原因之一。在后續(xù)試驗(yàn)中我們將通過提高蛋白純度及均一性或嘗試真核表達(dá)得到較高純度及均一性GIP蛋白，進(jìn)而培養(yǎng)出適宜解析其三維結(jié)構(gòu)的蛋白晶體，以期從更深層闡明GIP作用機(jī)理。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]Kikot G E， Hours R A， Alconada T M. Contribution of cell wall degrading enzymes to pathogenesis of Fusarium graminearum： a review[J]. Journal of Basic Microbiology， 2009， 49（3）： 231-241.

[2]Kamoun S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic Oomycetes[J]. Annual Review of Phytopathology， 2006， 44（1）： 41-60.

[3]Kauffmann S， Legrand M， Geoffroy P， et al. Biological function of pathogenesis-related proteins： four PR proteins of tobacco have 1， 3-beta-glucanase activity[J]. EMBO Journal， 1987， 6（11）： 3209-3212.

[4]Stintzi A， Heitz T， Prasad V， et al. Plant ‘pathogenesis-related proteins and their role in defense against pathogens[J]. Biochimie， 1993， 75（8）： 687-706.

[5]Ham K S， Wu S C， Darvill A G， et al. Fungal pathogens secrete an inhibitor protein that distinguishes isoforms of plant pathogenesis-related endo-1， 3-glucanases[J]. The Plant Journal， 2002， 11（2）： 169-179.

[6]趙爽， 楊柳， 楊亮， 等. 煙草β-1， 3-葡聚糖酶的蛋白序列分析[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 24（10）： 6-9.

[7]馬世明， 羅家佐， 王德勛， 等. 煙草β-1， 3-葡聚糖酶的生物學(xué)分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 46（17）： 96-97， 116.

[8]管翠萍， 王俊文， 王麗娟， 等. 枸杞LbXEGIP1基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 分子植物育種， 2018， 16（19）： 6235-6241.

[9]蔣選利， 李振岐， 康振生. β-1， 3-葡聚糖酶與植物的抗病性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2005， 14（4）： 135-139.

[10]Martins I M， Martins F， Belo H， et al. Cloning， characterization and in vitro and in planta expression of a glucanase inhibitor protein （GIP） of Phytophthora cinnamomi[J]. Molecular Biology Reports， 2014， 41（4）： 2453-2462.

[11]Damasceno C M B， Bishop J G， Ripoll D R， et al. Structure of the glucanase inhibitor protein （GIP） family from Phytophthora species suggests coevolution with plant endo-beta-1， 3-glucanases[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2008， 21（6）： 820-830.

[12]Scarafoni A， Consonni A， Pessina S， et al. Structural basis of the lack of endo-glucanase inhibitory activity of Lupinus albus γ-conglutin[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2016， 99： 79-85.

[13]George K J， Babu O R， Kumar I P V， et al. Interplay of genes in plant-pathogen interactions： in planta expression and docking studies of a beta 1， 3 glucanase gene from Piper colubrinum and a glucanase inhibitor gene from Phytophthora capsici[J]. Physiology & Molecular Biology of Plants An International Journal of Functional Plant Biology， 2016， 22（4）： 567-573.

[14]Zhang X G， Li F， Wang H Z. Comparison of expression， purification and characterization of a new pectate lyase from Phytophthora capsici using two different methods[J]. BMC Biotechnology， 2011， 11（32）： 1-7.

收稿日期：2019-07-12

基金項(xiàng)目：山東省引進(jìn)頂尖人才“一事一議”專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目;淄博市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2018kj010073）

通訊作者：王會征（1984—），男，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锊『捌渲虏C(jī)理。E-mail： hzwang@sdut.edu.cn