李星輝 雷林峰 喬燕 聶芳菲 馬婧 王晨晨 王立君

沙塵暴是全世界干旱地區(qū)較為常見的一種災害性天氣現象，指強風將地面塵沙吹起使空氣混濁，水平能見度＜1km，沙塵暴天氣易誘導發(fā)生各種疾病[1]。沙塵暴顆粒物中的有毒物質及病菌可經呼吸道進入人體，對機體健康造成損害，損害程度與沙塵暴顆粒物的來源、直徑及化學成分有關。目前，沙塵暴顆粒物已成為危害人類健康的主要因素之一，2002 年世界衛(wèi)生組織的估算結果表明，全球城市每年因顆粒物污染至少造成100 萬居民死亡和740 萬居民傷殘調整生命年的損失，而東南亞、東亞（包括中國）、南亞國家約承擔一半的損失，因為該地區(qū)顆粒物污染嚴重[2]。以往對沙塵暴顆粒物的研究多聚集在呼吸系統(tǒng)，對沙塵暴顆粒物在心血管系統(tǒng)的影響及其機制研究甚少，目前沙塵暴顆粒物污染與人群心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病及死亡的關系已逐漸成為研究熱點之一。相關學者已提出沙塵暴顆粒物致心血管系統(tǒng)疾病的可能機制，包括損傷血管內皮細胞、激發(fā)氧化應激和炎癥反應、引起血管舒縮功能及脂質功能障礙、促進血栓形成、促進動脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展等，這些過程又相互關聯(lián)，最終導致心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。本研究通過采集甘肅河西走廊沙塵暴顆粒，研究不同暴露劑量的沙塵暴PM2.5 對Wistar 大鼠心臟損傷的影響，闡述沙塵暴PM2.5 對心臟的炎性損傷反應，現報道如下。

1 實驗對象和方法

1.1 實驗對象及材料 32 只6 周齡SPF 級健康雄性Wistar 大鼠，體重180～200g，常規(guī)條件喂養(yǎng)2 周。實驗所用沙塵暴PM2.5 由甘肅省河西走廊地區(qū)武威市環(huán)境保護局監(jiān)測中心提供。使用TEOM1405D 雙通道顆粒物監(jiān)測儀來保證沙塵暴PM2.5 的粒徑大小，對于粒徑＜10μm 的顆粒物先經頂端的PM10 切割頭進入采樣系統(tǒng)，再被虛擬沖擊器分離為PMc 和PM2.5，進入雙通道的顆粒物分別聚積在系統(tǒng)可更換的TEOM 濾膜上。實驗所用沙塵暴顆粒物PM2.5均來自這些更換后的濾膜。

1.2 方法

1.2.1 沙塵暴PM2.5 溶液的配制 將采有沙塵暴PM2.5 的濾膜取出并裁剪成1cm×3cm 大小，浸入超純水中，超聲震蕩30min，共3 次，震蕩液用紗布過濾，濾液經冷凍真空干燥后得到沙塵暴PM2.5 粉末，置入-20℃冰箱保存。用電子天平稱取各暴露組所需沙塵暴顆粒物PM2.5 的量（低暴露組、中暴露組、高暴露組PM2.5 的量分別按1.5、6.0、24.0mg/kg 進行計算），并用無菌0.9%氯化鈉溶液配制成各暴露組所需的濃度，之后經超聲震蕩15min 混勻后備用。

1.2.2 沙塵暴PM2.5 暴露模型的建立 采用隨機數字表法將大鼠分為4 組，即沙塵暴PM2.5 低劑量暴露組（低暴露組）、中劑量暴露組（中暴露組）、高劑量暴露組（高暴露組）及空白對照組。以3ml/kg、10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部備皮，碘伏消毒，行頸前正中切口約1cm，分離皮下和肌肉組織暴露氣管，用6 號針頭與氣管稍呈角度刺入，經氣管緩慢滴入0.5ml 不同濃度的沙塵暴PM2.5，共滴注3 次，1 次/d，即暴露3 次?？瞻讓φ战M滴注等量0.9%氯化鈉溶液。每次沙塵暴PM2.5 暴露前及氣管滴注后24、48、72h 稱量記錄每只大鼠的體重。

1.2.3 大鼠血清炎癥因子的檢測及心臟組織的病理形態(tài)學觀察 建模成功后，采用先前的麻醉方法，剖開腹腔，暴露腹主動脈采血，靜置凝固后離心，3 000r/min，4℃，10min，置-20℃冰箱備用。采血完成后立即脫頸椎處死，充分暴露胸腔，剪去大血管，取出心臟組織，清洗后標記置凍存管備用。（1）采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分別測定4 組大鼠血清炎癥因子C反應蛋白（c-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（IL）-1、IL-6、IL-8 和巨噬細胞炎癥蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）水平。具體方法為：取樣；標準品加樣；空白孔和待測樣品孔加樣；加酶；溫育；洗滌；顯色；終止；測定；繪制標準曲線并計算。（2）組織切片制作及蘇木精-伊紅（HE）染色：固定；脫水；透明；透蠟；包埋；切片；貼片；染色；封固；顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4 組大鼠的體重變化比較 見表1。

由表1 可見，與暴露前比較，空白對照組大鼠體重在第1 次暴露后未見明顯減輕，結果無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。第1 次暴露后的高暴露組，第2 次暴露后的中、高暴露組，第3 次暴露后的低、中、高暴露組的大鼠體重均較空白對照組下降明顯（P＜0.05或0.01）。同時各暴露組大鼠毛發(fā)漸失去順滑感且光澤漸消失、呼吸急促、活動量減少、進食及飲水量明顯減少，而空白對照組大鼠上述變化不明顯。

2.2 4 組大鼠暴露72h 后炎癥因子比較 見表2。

由表2 可見，與空白對照組比較，低暴露組、中暴露組及高暴露組大鼠CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-2 水平均呈劑量依賴性升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 4 組大鼠心臟組織病理形態(tài)學變化 見圖1。

由圖1 可見，與空白對照組相比，低、中暴露組大鼠心肌細胞肥大，細胞間質變窄，但兩組未見明顯差異；而高暴露組大鼠心肌細胞明顯肥大，細胞間質明顯變窄；空白對照組未發(fā)現上述改變。4 組大鼠心臟組織切片未觀察到明顯的炎性細胞浸潤。

表1 4 組大鼠的體重變化比較（g）

表2 4 組大鼠暴露72h 后炎癥因子比較

圖1 4 組大鼠心臟組織病理圖（A：低暴露組；B：中暴露組；C：高暴露組；D：空白對照組；HE 染色，×200）

3 討論

我國西北地區(qū)由于獨特的自然環(huán)境和地理條件，屬于沙塵暴頻發(fā)帶，甘肅河西走廊地區(qū)是中國北方沙塵暴的第二大源區(qū)。筆者發(fā)現每當沙塵暴高發(fā)時期，當地醫(yī)院因心血管疾病就診率、住院率及病死率均有所增高，因此選取此地區(qū)沙塵標本進行相關動物實驗。已有研究揭示了人類和動物暴露于顆粒物與全身促炎反應具有相關性，從而造成心血管系統(tǒng)的損害[5-7]。研究表明，炎癥反應的產生及炎性因子的釋放在心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著至關重要的作用[8]。在本實驗中，我們選擇測量大鼠血 清 炎 癥 因 子 CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-2 水平來評估暴露于沙塵暴PM2.5 導致的炎癥反應。CRP 是全身炎癥的敏感標志物和心血管事件有價值的預測指標，TNF-α、IL-6、MIP-2 均具有促進炎癥發(fā)生和發(fā)展的作用。已有研究發(fā)現暴露于PM2.5，可引起血清CRP、IL-1、IL-6 水平升高，且IL-6 的升高水平與PM2.5 的暴露劑量呈正相關關系[9-10]。將小鼠暴露于顆粒物中，其血清MIP-2 的水平逐漸升高，在暴露后24h 炎癥反應程度最大[11]，顆粒物暴露也會導致TNF-α 水平升高[12]。研究發(fā)現暴露于不同濃度的PM2.5，24h 后血清中IL-1 的水平呈劑量依賴性升高，且48h 后IL-8 的水平隨暴露劑量的增加而逐漸升高[10，13]。上述研究結果與本實驗發(fā)現相吻合。

研究發(fā)現顆粒物誘導炎性介質的產生依賴于活性氧的生成和核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化[14]。暴露于不同濃度的PM2.5，NF-κB 蛋白表達量顯著增加，而NF-κB 抑制蛋白α 表 達 量 顯 著 下 降，NF-κB 可 通 過 控 制IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α 和一氧化氮合酶（iNOS）的直接或間接表達來調節(jié)炎癥反應[15-16]。核因子IκBα 可以抑制NF-κB 從細胞質向細胞核轉運，因此IκBα的下調被認為是NF-κB 活化的標志物[17]。以后的研究應圍繞顆粒物誘導炎癥細胞因子產生的相關機制進行。

本實驗發(fā)現成年Wistar 大鼠暴露于沙塵暴PM2.5 后，可出現暴露組大鼠體重明顯減輕，推測可能是皮膚切開對大鼠屬于外傷性刺激，可直接導致氣管滴注后大鼠進食和飲水量的減少，從而引起大鼠體重下降，但由于隨顆粒物暴露劑量的增加而減輕明顯，也不能排外暴露于沙塵暴PM2.5 后產生的毒性反應所致。在本研究中，各組大鼠心臟組織切片經HE 染色后，在光學顯微鏡下發(fā)現暴露組大鼠心肌細胞呈現不同程度的肥大。中暴露組與低暴露組相比，心肌細胞肥大程度未見明顯差異，可能與兩組PM2.5 暴露劑量相差不大有關，而高暴露組心肌細胞明顯肥大，細胞間質明顯變窄，推測與暴露時間、濃度相關。而上述各組大鼠心臟組織切片均未觀察到明顯的炎性細胞浸潤。已有研究發(fā)現，小鼠暴露于顆粒物中2d 后，僅在心臟右心室組織切片中觀察到心肌細胞肥大及炎癥細胞浸潤[18]。但也有部分研究者發(fā)現，Wistar 大鼠經氣管滴注PM10 2d 后，在大鼠心臟組織切片中未觀察到心肌細胞炎性反應改變[19]。究其原因，可能與本實驗中采用心臟的心尖部分作HE 染色切片有關，而心尖組織大部分屬于左心室，可能也與顆粒物暴露時間長短有一定的關聯(lián)。

總之，暴露于沙塵暴PM2.5 可誘導血清炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-2 的產生及心臟的炎性損傷，從而導致心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。本實驗未對沙塵暴顆粒物的成分及理化性質等進行研究，這些因素也會對上述實驗結果產生一定的影響，今后的實驗中應進一步改進。