湛詠詩(shī) 廖華衛(wèi) 周雄堅(jiān)

摘? 要：目的 研究油茶餅粕中茶皂素的分離純化方法。方法 采用紫外分光光度法對(duì)萃取法、薄層色譜分離法及柱層析法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。結(jié)果 萃取后樣品純度35%，薄層板制備后樣品純度60%，柱層析后樣品純度86%。結(jié)論 茶皂素的初步研究效果較佳。

關(guān)鍵詞：茶皂素? 分離純化? 薄層色譜? 柱層析

中圖分類號(hào)：Q946 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2019）10（a）-0032-02

Abstract： Objective： To study the separation and purification of tea saponin from Camellia oleifera. Methods：Ultraviolet spectrophotometry was used to detect the extraction method， thin layer chromatography and column chromatography. Results：The purity of the sample after extraction was 35%. The purity of the sample after preparation of the thin layer plate was 60%， and the purity of the sample after column chromatography was 86%. Conclusion： The preliminary study of tea saponin has better effect.

Key Words： Tea saponin; Separation and purification; Thin layer chromatography; Column chromatography

油茶籽榨取茶油后剩下的渣餅即為油茶餅粕，是茶油生產(chǎn)的下腳料茶皂素又名茶皂甙，是一種優(yōu)良的非離子型天然表面活性劑，具有溶血、抗菌、抗病毒、抗應(yīng)激、降血脂等多種生理活性，可廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、食品和農(nóng)藥等行業(yè)。茶皂素是一類結(jié)構(gòu)相似的齊墩果烷型三萜類皂苷混合物，其單體結(jié)構(gòu)稱為茶皂苷，由皂苷元、糖體、有機(jī)酸（或糖醛酸）3個(gè)部分組成。茶皂素為乳白色或淡黃色無(wú)定形粉末，平均分子式為 C57H90O26，相對(duì)分子量為1200～2800左右，熔點(diǎn)223℃～224℃，是一種非離子型極性物質(zhì)[1]，該實(shí)驗(yàn)采取萃取、TLC色譜法、柱層析法等分離純化方法，為建立茶皂素的分離純化方法提供參考依據(jù)。

1? 儀器與試劑

儀器：紫外可見分光光度計(jì)UV-6100S。

試劑：硫酸、香草醛、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純茶皂素對(duì)照品（B20145，上海源葉生物科技有限公司）

2? 方法與結(jié)果

2.1 油茶枯預(yù)處理及茶皂素的提取

2.1.1 油茶枯預(yù)處理

取油茶枯1kg，粉碎，于60℃條件下干燥4h，控制水分<5%，粉碎過60目篩，然后加一定量的石油醚（30～60），經(jīng)索氏抽提至提取液無(wú)色，除去油脂。將除去油脂后的茶籽粕置于通風(fēng)良好處使其自然風(fēng)干，然后放入60℃烘干，備用。

2.1.2 茶皂素的提取

取2.1.1中油茶枯預(yù)處理好的樣品100g置于2000mL的三角瓶中，按1∶10的比例加入50%乙醇，超聲波提取，每次2h，提取3次。抽濾，濾液合并，回收乙醇，濾液水浴濃縮至200g即可（備用）。

2.2 茶皂素含量測(cè)定方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取一個(gè)20mL容量瓶準(zhǔn)確配制濃度2mg/mt的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，用移液槍精確移取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分別放置于5個(gè)比色管中，并加水至溶液體積均為0.5mL。精密加入8%香草醛95%乙醇溶液0.5mL，將比色管置于冰水混合物中，移取77%的濃硫酸4mL加入比色管中，振蕩后于60℃的水浴鍋中水浴15min，然后將比色管放置于冰水混合物中反應(yīng)10min，取出放置至室溫，以試劑空白為對(duì)照，在其最大吸收波長(zhǎng)550nm處測(cè)定其吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，得到線性標(biāo)準(zhǔn)方程。

2.2.2 含量測(cè)定

取提取液0.5mL，置于比色管中，精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL，將比色管置于冰水混合物中，移取77%的濃硫酸4mL加入比色管中，振蕩后于60℃的水浴鍋中水浴15min，然后將比色管放置于冰水混合物中反應(yīng)10min，取出使其恢復(fù)室溫，以試劑空白為對(duì)照，在其最大吸收波長(zhǎng)550nm處測(cè)定其吸光度[2]，依據(jù)2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

2.3 樣品液的萃取

將上述溶液置于1000mL的分液漏斗中，先用石油醚（60～90）萃取，每次200mL，共3次，合并萃取液，濃縮（備用）。再用乙酸乙酯萃取，每次200mL，共3次，合并萃取液，濃縮（備用）。最后用正丁醇萃取，每次200mL，共3次，合并萃取液，濃縮至干（備用）。

2.4 TLC色譜法

將上述正丁醇萃取部位的樣品用熱乙醇溶解，每次30mL，共3次，合并溶液。濃縮轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中作為樣品溶液（備用）。將樣品溶液點(diǎn)于已活化好的10cmx10cm的薄層板上，在1.5cm處帶狀點(diǎn)樣，在相應(yīng)的位置點(diǎn)茶皂素對(duì)照品溶液，以乙酸乙酯-乙醇（1∶4）為展開劑展開，展開至約8.5cm處即可，取出，晾干，碘熏顯色，用鉛筆做好記號(hào)，取出，記號(hào)范圍適當(dāng)擴(kuò)大，將吸附有樣品的吸附劑按色帶的位置刮下，收集好，置于層析柱上，用熱乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至10mL（備用）。

2.5 柱層析分離純化

將10g柱層析硅膠（100～200目）加入到上述溶液中，置于蒸發(fā)皿中，攪拌均勻，水浴蒸干，80℃烘干，備用。稱取300g已經(jīng)活化好的柱層析硅膠（100～200目），以乙酸乙酯-乙醇（4∶1）裝柱，裝好柱后用洗脫劑洗脫一天，干法上樣，上好樣品后在硅膠上加一團(tuán)脫脂棉，打開活塞，進(jìn)行洗脫，收集流份，每瓶約20mL，薄層色譜檢測(cè)，合并茶皂素流份，回收洗脫劑，水浴蒸干，熱乙醇適量溶解，濾過，放冷析晶。濾過，收集結(jié)晶，烘干，依樣品測(cè)定方法測(cè)定含量。濾液也依樣品測(cè)定方法測(cè)定含量。觀察各自的含量情況，從而為摸索一個(gè)更好地分離純化方法提供參考。

3? 討論

此次實(shí)驗(yàn)摸索了茶皂素的分離純化方法，每一步都進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，總體了解了茶皂素的占比情況，為以后進(jìn)一步的研究提供技術(shù)支撐。此次實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)，容易學(xué)習(xí)領(lǐng)會(huì)，通俗易懂，萃取過程中，通過收集3種萃取溶液，分別跟蹤檢測(cè)，得到乙酸乙酯部位茶皂素占比約10%，正丁醇部位茶皂素占比約71%，剩余母液茶皂素占比約6%;薄層色譜制備中，展開系統(tǒng)選擇很重要，層析板鋪的好壞也對(duì)分離效果影響較大，跟茶皂素相應(yīng)部位的斑點(diǎn)處刮下后處理得到的茶皂素占比約75%，為了更深入地了解茶皂素的占比情況，斑點(diǎn)之上之下分別檢測(cè)，之上斑點(diǎn)處刮下的硅膠粉經(jīng)處理后檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)茶皂素占比約11%，之下斑點(diǎn)處刮下的硅膠粉經(jīng)處理后檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)茶皂素占比約4%;另外柱層析中，裝柱的好壞也是分離效果好壞的較為重要的因素。但回收率偏低，下一步努力的方向。設(shè)想如果每一步重復(fù)做多一次，估計(jì)會(huì)提高樣品的得率及純度。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄧桂蘭.茶皂素的提取及純化研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（8）：197-204.

[2] 傅春玲，洪奇華，阮輝，等.茶皂素定量測(cè)定方法的研究[J].杭州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1997，24（3）：240-242.