王旭靜 靳桂勇 王秀粉 馬雪彬 劉秋珂

摘要：從內(nèi)蒙古哈馬太湖中分離得到一株淡水硅藻NW129，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，該藻株與菱形藻屬的普通菱形藻親緣關(guān)系最近。該藻在溫度28 ℃、光照100 μmol/（m2·s）、光暗周期12 h∶12 h，搖床轉(zhuǎn)速為160 rpm的條件下培養(yǎng)。在Zarrouk培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)25 d。培養(yǎng)12 d，干重達(dá)到1.06 g/L，每天平均生長率為0.10 g/（L·d），培養(yǎng)至25 d，干重達(dá)到1.95 g/L，后13 d的平均生長率僅為0.08 g/（L·d）。整個(gè)生長過程中，培養(yǎng)液pH從初始的9.20增至12.30。培養(yǎng)25 d后，采收藻細(xì)胞總脂含量為24.00%，可溶性蛋白為12.00%，多糖比例為3.35%，巖藻黃素含量達(dá)13.06 mg/g。結(jié)果表明，該藻株速生性狀突出，對高 pH耐受能力強(qiáng)，巖藻黃素含量高，是一株具有開發(fā)應(yīng)用潛力的藻株。

關(guān)鍵詞：菱形藻;分離鑒定;生長特性;理化成分

優(yōu)良藻種是進(jìn)行微藻規(guī)模化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，作為可規(guī)?；a(chǎn)的微藻須要富含生物活性成分，具有突出的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，生長快速，對溫度及光照變化適應(yīng)能力強(qiáng)，能夠抵抗輪蟲以及雜藻的污染等[1]。目前國內(nèi)外已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)藻種有螺旋藻、鹽藻、小球藻。其中螺旋藻耐受高堿、鹽藻耐受高鹽、小球藻生長快速，這些微藻富含蛋白或者生物活性成分，常用于生產(chǎn)保健品、食品添加劑等[2-3]。

內(nèi)蒙古哈馬太湖（108°02′E，39°06′N）位于鄂爾多斯高原鄂托克旗，常年水深1.5 m，四季溫度12.5～26 ℃，pH8.5以上，最高達(dá)16.3。近20年來，在堿湖附近有400 hm2的螺旋藻養(yǎng)殖工廠，每年約有80萬噸養(yǎng)殖廢水排入哈馬太湖，這些養(yǎng)殖廢水鹽度高、堿度高、pH高[4]，形成了湖水鹽堿度高的環(huán)境。本研究在堿湖中分離到一株梭形的藻株，在對該株微藻分離純化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了培養(yǎng)，并對該藻株的可溶性蛋白、多糖、總脂及色素等理化成分進(jìn)行了分析，以期為該分離微藻的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1藻種分離鑒定

1.1.1藻株分離程序?qū)⒐R太湖中采集的水樣鏡檢，發(fā)現(xiàn)除螺旋藻外還有一株硅藻，呈梭形。采用微吸管法定向分離該藻株。在Zarrouk培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)7 d，倒置顯微鏡下吸取單細(xì)胞至24孔板中培養(yǎng)7～14 d，鏡檢選取目的藻株純度較高的孔進(jìn)一步在48孔板中進(jìn)行梯度稀釋純化，培養(yǎng)28 d，取稀釋濃度最低孔板里的藻液，即為目的藻株純化株。隨后，將純化藻株接種在滅菌的固體Zarrouk培養(yǎng)基（固體Zarrouk培養(yǎng)基是在液體Zarrouk培養(yǎng)基中加入1%的瓊脂高壓滅菌）中，進(jìn)行純化。在光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s）、溫度28 ℃、光暗比12 h∶12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3周后固體培養(yǎng)基上開始出現(xiàn)藻落，挑取單藻落在Zarrouk液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得單克隆純化藻株。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對分離藻株的編號序列，暫定代號為NW129。

1.1.2分離藻株的鑒定在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)并測量其大小，進(jìn)行藻種的初步鑒定。在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，進(jìn)行藻株的分子生物學(xué)鑒定。取生長對數(shù)期微藻，CTAB法提取微藻基因組DNA[5]。18SrDNA擴(kuò)增使用硅藻通用引物（正向序列467F：5-TGGTGGAGTGATTTGTCTGG-3;反向序列467R：5-CATTCAGGTAGGTGC-3）[6]，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度400 bp。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，模版1 μL，上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶12.5 μL，無菌水10.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得預(yù)期擴(kuò)增序列?；厥占兓疨CR產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。獲得的18S rDNA序列經(jīng)與GenBank中相關(guān)序列信息進(jìn)行BLAST相似性搜索，選取相似性大于97%的序列在BioEdit中進(jìn)行多序列對齊，用MEGA5.1鄰接法（Neighbor-joining）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)1 000次計(jì)算bootstrap值。

1.2生長特性分析

1.2.1分離藻株培養(yǎng)將微藻培養(yǎng)至指數(shù)生長末期，離心去上清，以生物量為0.2 g/L的初始接種密度接種至Zarrouk培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)25 d。基于哈馬太湖的生境條件以及藻種的采集時(shí)間（高溫干旱的7月份），本研究設(shè)置該藻的初始培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，光照強(qiáng)度100 μmol/m2/s，光暗周期：12 h∶12 h，搖床轉(zhuǎn)速160 rpm。

1.2.2分離藻株生物量、pH和比生長速率測定微藻生長過程中，每天定時(shí)取樣測藻液的生物量和pH，繪制生物量和pH日變化曲線。真空抽濾5 mL的藻液至預(yù)先測重的GF/CTM（WhatmanTM公司）玻璃纖維素濾膜上（預(yù)先烘至恒重），放置60 ℃烘箱烘至恒重，冷卻至室溫稱重，根據(jù)重量差計(jì)算出單位藻液生物量（g/L）。

基于測量的生物量值，計(jì)算比生長速率。比生長速率根據(jù)公式μ=ln（N2/N1）/（T2-T1）計(jì)算;其中，T2和T1分別代表培養(yǎng)時(shí)間，T2>T1，N2和N1分別為時(shí)間T2和T1時(shí)的微藻生物量。

1.3理化成分分析

1.3.1總脂含量總脂含量基于Bligh and Dyer的重量法測定[7]。取冷凍干燥的藻粉40 mg（m0）于EP管中，加入2 mL氯仿和1 mL甲醇，混勻后超聲破碎20 min（2 s超聲處理+2 s間隔時(shí)間，功率為30%），破碎后的樣品8 000 rpm離心10 min，收集上清到新EP管中，重復(fù)三次;合并所有上清液，加入1.2 mL0.9%的NaCl溶液，渦旋震蕩5 min，靜置分層;用1 mL注射器吸取下層氯仿層，轉(zhuǎn)移至事先稱重過的玻璃管（m1）中;將玻璃管置于50 ℃水浴鍋中24 h，待液體揮發(fā)完全后，將玻璃管轉(zhuǎn)移至60 ℃烘箱中烘干，冷卻至室溫記錄重量為m2。總脂含量公式：LW（%）=（（m2-m1）/m0）×100%。

1.3.2可溶性蛋白含量采用BCA法測定。BCA試劑與Cu試劑按照50∶1的比例配制成BCA工作液，混勻。稱量30 mg冷凍干燥的藻粉于EP管中，加入1 mL裂解液，加入蛋白酶抑制劑，超聲破碎20 min（2 s超聲處理+2 s間隔時(shí)間，功率為30%）。離心，取上清20 μL加入到96孔板的樣品孔中，加入200 μL BCA工作液，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀測量562 nm的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性蛋白含量。

1.3.3多糖含量采用蒽酮比色法（Chaplin and Kennedy ，1986）[8]。稱取10 mg冷凍干燥的藻粉，加入3 mL PBS，混勻，超聲破碎20 min，細(xì)胞破碎完全后，充分震蕩，沸水浴30 min，吸取2 mL溶液，加入0.1 mL硫酸鋅溶液，沸水浴5 min，加入0.2 mL亞鐵氰化鉀，充分混勻，3 000 g離心10 min，吸取1 mL上清液于干凈的玻璃管中，加入硫酸蒽酮溶液4 mL，沸水浴10 min，冷水迅速冷卻，室溫平衡15 min，以1 mL PBS與4 mL蒽酮溶液做參比，測量620 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出葡萄糖含量。

1.3.4巖藻黃素含量參照Kim（2012）[9]。取10 mg冷凍干燥的藻粉，均質(zhì)機(jī)破碎2 min，加入1 mL乙醇（HPLC級），搖床200 rpm 0 ℃暗處理1 h，6 000 rpm離心5 min，收集上清至新EP管中;重復(fù)兩次。合并上清，0.22 μm過濾器過濾，整個(gè)處理過程均在低溫避光條件下進(jìn)行。

提取物中的巖藻黃素含量采用RP-HPLC分析測定。HPLC分析采用島津高效液相色譜系統(tǒng)（二元泵單元、自動進(jìn)樣器、PAD檢測器），YMC C30柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相由A液（乙腈：水，體積比為9∶1）和B液（乙酸乙酯）組成。梯度洗脫[10]：從100%A線性變化到100%B，20～22 min;從100%B線性變化到100%A，22～23 min;100%A，23～35 min。柱溫：40 ℃。流速為1.0 mL/ min。進(jìn)樣量為10 μL?；跇?biāo)準(zhǔn)品制作“濃度——色譜峰面積”標(biāo)準(zhǔn)曲線，在445 nm處檢測巖藻黃素的含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)都設(shè)置三個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)采用軟件SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并進(jìn)行多重比較（S-N-K），數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，顯著水平P<0.05，采用Microsoft office 2016繪圖。

2結(jié)果與討論

2.1藻種鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)觀察光鏡下分離藻株NW129細(xì)胞（見圖1）呈褐棕色，單個(gè)呈梭形，中部膨大，細(xì)胞核位于兩個(gè)黃褐色盤狀色素體中間，兩端呈鈍圓形，長約18～20 μm，最寬處約6 μm。與菱形藻屬微藻形態(tài)相近。目前報(bào)道的菱形藻屬微藻長15～150 μm不等，寬約1～6 μm[11]。Suh Nih Tan[12]等人從馬來西亞紅樹林中分離得到的Nitzschia navis-varingica長88.5 μm，寬5.7 μm，細(xì)胞有兩個(gè)黃褐色盤狀葉綠體，細(xì)胞核位于兩個(gè)色素體中間。

2.1.2分子生物學(xué)鑒定本實(shí)驗(yàn)將擴(kuò)增得到的分離藻株18SrDNA序列測序，經(jīng)BLAST比對進(jìn)行相似性搜索，選取GenBank中與NW129相似性大于97%且序列信息均為菱形藻屬的微藻，以小環(huán)藻（Cyclotella cryptica）相應(yīng)序列為外類群，采用Mega5.1軟件的鄰接法（Neighbor-joining）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖2）。結(jié)果顯示該分離藻株的18S rDNA與菱形藻屬的普通菱形藻（Nitzschia communis T3-NC11（KM3877171））序列相似度最高，在NJ樹上聚為一支，但相似距離僅為86%。菱形藻屬是硅藻中比較大的類群之一，但該屬物種鑒定存在很多爭議，形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)角度都認(rèn)為，菱形藻不是自然的分類群體，該屬是多系發(fā)生的[13-14]，并且分類體系尚未確定，在鑒定方面還存在著很多困難，本研究只能將該藻株定為菱形藻屬的微藻。

2.2生長特性分析

目前已知菱形藻屬微藻生境極為廣泛，淡水、海水、河口區(qū)都可以生長[15]，包括底棲物種和浮游物種。在實(shí)驗(yàn)室條件下，海洋菱形藻一般培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)基中[16]，淡水菱形藻在BG11、BBM、CHU10、D1培養(yǎng)基中均可能生長[17-21]，菱形藻適宜的pH范圍為6.4～8.2。 Mustafa Suha Sahin[17]將Nitzschia sp. （EGEMACC 49） 在100 μmol/（m2·s）、28 ℃、f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，終生物量為0.638 g/L。Mariana Machado[19]等人在BG11培養(yǎng)基、100 μLmol/（m2·s）、24 ℃條件下培養(yǎng)了兩株Nitzschia palea各6 d，BR006和BR022的比生長速率分別為0.82 d-1、0.56 d-1;但未見菱形藻在Zarrouk培養(yǎng)基生長的報(bào)道，而本實(shí)驗(yàn)分離得到的淡水菱形藻NW129可以在Zarrouk培養(yǎng)基中快速生長。

本實(shí)驗(yàn)分離藻株來自內(nèi)蒙古哈馬太湖，湖水pH較高，本實(shí)驗(yàn)使用的Zarrouk培養(yǎng)基初始pH為9.2，采用了與哈馬太湖相似堿環(huán)境。在Zarrouk培養(yǎng)基中，NW129在接種的第二天即進(jìn)入指數(shù)生長階段，生物量從初始接種0.2 g/L增加至0.29 g/L，至培養(yǎng)的第9天生物量達(dá)1.06 g/L，隨后進(jìn)入緩慢的增長階段，第12天生物量為1.09 g/L。伴隨藻細(xì)胞的增殖，藻液的pH也從最初的9.2逐漸升高至9.94。該階段的比生長速率為0.10 g/L/d。從培養(yǎng)的第13天，NW129又表現(xiàn)出快速增長的趨勢，第22天生物量達(dá)到最大1.95 g/L，pH增加至11.45，第25天該藻的干重達(dá)到1.93 g/L， pH達(dá)12.30。該階段的比生長速率為0.08 g/L/d。該藻在整個(gè)生長過程中，生物量不斷增加， pH也隨之呈現(xiàn)上升趨勢，表現(xiàn)出了持續(xù)的增長趨勢和較高的生物量，突出的pH耐受特性。其中對高pH的耐受性，戶外培養(yǎng)過程中，有利于抵抗雜藻、輪蟲等敵害生物對微藻培養(yǎng)的危害。

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Separation， identification and assessing of potential application of a strain of Nitzschia sp. in Hamatai Lake

WANG Xujing1， JIN Guiyong1， WANG Xiufen1， MA Xuebin1， LIU Qiuke1

（1. Key Laboratory of Mariculture， ministry of Education， Ocean University of China Qingdao， 266003，China;）

Abstract：A freshwater diatom of Nitzschia sp. named NW129 was isolated from the Hamatai Lake in Inner Mongolia and identified by morphology and molecular biology， which was similar to the common Nitzschia. The optimum conditions were： Zarrouke medium， temperature of the shaking table 28 °C， a photon flux density of 100 ?μmol/m2/s， a 12 h∶12 h light：dark cycle， and rotating speed 160 rpm. In Zarrouke medium， NW129 was cultured for 25 days. In the first 12 days， the biomass and average growth rate were respectively 1.06 g/L and 0.10 g/L/d. In the last 13 days， its biomass was up to 195 g/L， while its growth rate was 0.080 g/L/d. During the period of 25 days， pH of the medium was from 9.20 to 12.30. After 25 days of culture period， the total lipid， soluble protein， polysaccharides of the strain were 24.00%， 12.00%， 3.35%， respectively. And the content of fucoxanthin was 13.06 mg/g. The results show that there is a strain with tremendous potential application which has outstanding characters of faster growth， stranger tolerance of high pH， as well as higher content fucoxanthin.

Key words：Nitzschia sp.; separation identification; growth characteristics; physical and chemical composition