王瑞鵬 馮國棟 徐煥煥 王瑩瑩 張恩啟 牛向麗

摘要?根據(jù)萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序分析結果克隆PDS基因（TePDS1），并構建植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導法將TePDS1進行番茄遺傳轉(zhuǎn)化。試驗結果顯示，TePDS1已整合于番茄基因組中，獲得了表達萬壽菊PDS基因的番茄植株，且轉(zhuǎn)化番茄果實中的番茄紅素含量明顯高于野生型，表明TePDS1基因具有功能活性，可用于提高植物果實中色素含量。

關鍵詞?萬壽菊;八氫番茄紅素脫氫酶;番茄;遺傳轉(zhuǎn)化;番茄紅素

中圖分類號?Q943.2文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0107-04

Abstract?In this study， PDS gene （TePDS1） was cloned according to the transcriptome sequencing analysis of Tagetes erecta， and the plant expression vector of TePDS1 was constructed for transformation by Agrobacteriummediated method. The results showed that TePDS1 had been integrated into tomato genome， and tomato plants expressing marigold PDS gene were obtained. The content of lycopene in transformed tomato fruits was significantly higher than that of wild type， which suggested that TePDS1 had functional activity and could be applied for improvement of pigment content in fruits.

Key words?Tagetes erecta;Phytoene desaturase;Tomato;Genetic transformation;Lycopene

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，屬于萜類有機化合物[1]。迄今，被發(fā)現(xiàn)的天然類胡蘿卜素已達600多種，對人體營養(yǎng)有意義的有40～50種[2]。番茄紅素（lycopene）是類胡蘿卜素的一種，也是這一生物合成途徑中的上游產(chǎn)物。植物中類胡蘿卜素生物合成途徑為：兩分子的牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）在八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）作用下縮合產(chǎn)生八氫番茄紅素，八氫番茄紅素經(jīng)由八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturas，PDS）等酶的共同作用生成番茄紅素[3]。因此，PDS是類胡蘿卜素合成途徑的關鍵酶之一[4]。隨著人們對八氫番茄紅素脫氫酶關注度的提高，編碼PDS的基因序列也從藍細菌、藻類和高等模式植物中進行了克隆分離[5]，進而對其序列特征以及它們在類胡蘿卜素合成途徑、光保護中的作用進行了研究，期望能將不同來源的PDS基因用于作物色素營養(yǎng)品質(zhì)改良。

萬壽菊（Tagetes erecta）為菊科萬壽菊屬一年生草本植物，原產(chǎn)于墨西哥及中美洲[6]，具有易于栽培、花形大且絢麗多彩，植株能夠較強吸收二氧化硫等特點[7-9]，是觀賞和綠化花卉之一。同時，萬壽菊花中富含類胡蘿卜素，而類胡蘿卜素是維護人體健康所必需的攝入營養(yǎng)素，具有抗氧化、抗癌、預防心血管疾病等功能[10]。作為提取天然類胡蘿卜素的重要植物資源，萬壽菊又具有食用及藥用價值，

可用于食品、藥品、飼料及化妝品等的生產(chǎn)[11]。筆者前期工作中，通過對萬壽菊不同組織、花發(fā)育階段組織進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，獲得了PDS基因組裝序列，并從花中克隆分離了該基因，命名為TePDS1。筆者通過構建TePDS1植物表達載體、番茄遺傳轉(zhuǎn)化、鑒定，及果實中的番茄紅素含量測定，分析TePDS1基因功能活性，并對其用于培育和篩選高色素植物材料進行探討。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?植物材料。萬壽菊品種Juwang、野生型番茄品種Micro-Tom的種子由筆者所在實驗室保存，種植于合肥工業(yè)大學植物培養(yǎng)室。

1.1.2?菌株與載體。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5a、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105、植物表達載體pBI121，均由筆者所在實驗室保存。

1.1.3?儀器與試劑。Alliance E2695高效液相色譜儀（美國WARTERS公司）;Hitachi UH5300雙光束分光光度計（日本日立公司）;Nano Drop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司）;基因擴增儀（美國 ABI公司）。Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶購于Invitrogen公司;高保真DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒購于天根生化科技有限公司;T4 DNA Ligase，購于Thermo Scientific;限制性內(nèi)切酶Xba I、Sac I，購于大連寶生物公司;引物設計采用Primmer Premmier 5.0軟件，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;番茄紅素標準品購于上海源葉生物科技有限公司;乙腈、二氯甲烷、甲醇為國產(chǎn)色譜純。其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2?方法

1.2.1?TePDS1基因生物信息學分析。

利用ExPASy軟件（http：//web.expasy.org/protparam/），對實驗室前期獲得的萬壽菊TePDS1（MF421535）編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。通過同源建模方法（SWISS-MODEL），對TePDS1進行蛋白質(zhì)三級結構預測。同時，在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過比對搜索其他植物物種PDS基因序列，使用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）繪制系統(tǒng)進化樹，分析TePDS1的進化關系。

1.2.2?植物表達載體構建。

利用Trizol法提取萬壽菊成熟花的總RNA，超微量分光光度計檢測濃度、質(zhì)量后用于反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)TePDS1基因序列設計引物PDS1F（TGCTCTAGAATGTCTCTGTTATCAGCCACCA）和PDS1R（AAAGAGCTCTTAGACCAGACTTGCTTCAGCA），并引入Xba I、Sac I酶切位點。以cDNA為模板，對TePDS1進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、純化后，以Xba I 和 Sac I進行酶切，同時對pBI121植物表達載體以相同的酶進行酶切。酶切片段進行膠回收、連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定后進行測序驗證，構建pBI121-TePDS1載體。利用凍融法將所構建載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，鑒定篩選陽性克隆，于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.3?TePDS1基因番茄遺傳轉(zhuǎn)化。

將Micro-Tom番茄種子經(jīng)75%乙醇、15%次氯酸鈉表面殺菌、清洗后置于1/2 MS培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3 d，露白后光照培養(yǎng)4 d，獲得無菌番茄幼苗。剪下幼苗子葉和莖段光照預培養(yǎng)3 d。利用農(nóng)桿菌介導法，將帶有pBI121-TePDS1載體的農(nóng)桿菌（OD600=0.5～0.6）侵染預培養(yǎng)子葉和莖段15 min，然后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)2 d。將轉(zhuǎn)化愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素的篩選培養(yǎng)基（濃度依次為60、65和70 μg/mL），繼代培養(yǎng)約60 d，挑選生長較好的分化小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基誘導生根，然后移栽至土壤中，獲得番茄轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.4?轉(zhuǎn)基因植株鑒定與表型分析。

以CTAB法從野生型、TePDS1轉(zhuǎn)化番茄植株葉片提取基因組DNA。由于pBI121載體中帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 Ⅱ（NPTⅡ，AF485783）基因片段，可根據(jù)其序列設計引物（NPTⅡ-F，AGACAATCGGCTGCTCTGAT;NPTⅡ-R，TCATTTCGAACCCCAGAGTC）進行PCR擴增，對轉(zhuǎn)基因植株進行DNA水平鑒定。取野生型、TePDS1轉(zhuǎn)化番茄植株葉片提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，番茄UBI3基因（NM001346406）為內(nèi)參進行定量分析。定量引物分別為RTPDS1F（GCTCATACTATTACGGCTCGTCATC）、RTPDS1R（GTGAAGGTGGAAGACAAGTAAGCAG）和UBI13F（AGGTTGATGACACTGGAAAGGTT）、 UBI3R（AATCGCCTCCAGCCTTGTTGTA）。

取野生型、TePDS1表達的陽性轉(zhuǎn)化番茄植株成熟果實外果，加入液氮研磨成粉末，稱取約2 g于試管中。加入1.6 mL的BHT-乙醇溶液，渦旋振蕩15 s。接著加入50% KOH溶液0.4 mL，渦旋振蕩15 s后，置于60 ℃水浴鍋水浴1 h，每隔15 min渦旋振蕩1次。用2 mL丙酮超聲提取3次，合并提取后混勻。吸取3 mL提取液過濾，采用高效液相色譜法（HPLC）測定番茄紅素含量。高效液相色譜條件：色譜柱為Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流動相為乙腈∶二氯甲烷∶甲醇=7∶2∶1;流速為1 mL/min;檢測波長472 nm;進樣體積10 μL[12-13]。

2?結果與分析

2.1?TePDS1基因生物信息學分析

采用ExPASy軟件對TePDS1編碼蛋白理化性質(zhì)進行分析，結果顯示TePDS1編碼550個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為62 kD;等電點為6.34;不穩(wěn)定系數(shù)為46.63，屬于不穩(wěn)定蛋白;親水性平均值為-0.117，屬于親水性蛋白。同源建模方法對TePDS1蛋白的三級結構預測如圖1a所示。同時，系統(tǒng)進化（圖1b）分析表明，在已報道向日葵（KF263656.1）、旋覆花（KY761959.1）、北野菊（KC202430.1）、萵苣（LOC111915314）、番木瓜（DQ666830.2）、番茄（Solyc544073）、擬南芥（Artha827061）、葡萄（JQ319635.1）、水稻（LOC4331854）PDS基因序列中，萬壽菊TePDS1與向日葵同源基因的一致性最高。

2.2?植物表達載體構建

以萬壽菊成熟花cDNA為模板，PCR擴增TePDS1基因編碼序列。經(jīng)凝膠電泳檢測，顯現(xiàn)預期1 653 bp條帶（圖2a）。將純化PCR產(chǎn)物、載體pBI121分別進行Xba I 和 Sac I酶切，酶切產(chǎn)物膠回收后，連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，結果如圖2b所示，陽性克隆擴增得到與正對照大小一致條帶。取陽性單克隆轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，以Xba I 和 Sac I進行酶切鑒定（圖2c），獲得預期大小條帶。將酶切鑒定陽性克隆進行測序，測序結果顯示與目的基因序列相一致，表明pBI121-TePDS1載體構建完成。

2.3?TePDS1轉(zhuǎn)基因番茄植株鑒定

利用上述農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得番茄轉(zhuǎn)基因植株。提取TePDS1轉(zhuǎn)化番茄植株基因組DNA。以野生型為對照，進行pBI121表達載體篩選標記NPTⅡ基因PCR擴增。結果如圖3a所示，野生型未顯現(xiàn)擴增條帶，陽性轉(zhuǎn)化植株擴增獲得與正對照pBI121質(zhì)粒相同大小特異條帶。在TePDS1轉(zhuǎn)化植株中，共有7株為陽性，轉(zhuǎn)化片段已整合于基因組DNA。

取陽性轉(zhuǎn)基因植株葉片，Trizol法提取總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行定量PCR檢測。由于TePDS1是萬壽菊的功能基因，且與番茄同源基因的同源性較低，所以TePDS1基因在野生型番茄中無擴增產(chǎn)物。由于未進行萬壽菊基因轉(zhuǎn)化的野生型番茄在TePDS1定量檢測中沒有對應Cq值，在數(shù)據(jù)分析時采用轉(zhuǎn)基因植株中導入外源基因與內(nèi)參基因的Cq值差（ΔCq）描述各植株導入基因的表達水平（圖3b）。ΔCq值越小，則表明轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)轉(zhuǎn)入目的基因的表達量越高。結果顯示，轉(zhuǎn)基因番茄陽性植物中表達了不同水平的萬壽菊類胡蘿卜素合成途徑基因TePDS1，其中表達量最高的是3號植株，其次是4號和6號植株。

2.4?TePDS1轉(zhuǎn)化番茄植株表型分析

根據(jù)分子鑒定結果獲得萬壽菊TePDS1基因的番茄轉(zhuǎn)化植株。通過與野生型植株進行比較（圖4a），表明TePDS1基因轉(zhuǎn)入在葉片大小、株高、開花時間和果實熟期等方面對番茄未有明顯影響。但TePDS1基因轉(zhuǎn)化番茄植株的果實顏色較野生型深（圖4b）。

取陽性轉(zhuǎn)化植株TePDS1-3、TePDS1-4和TePDS1-6成熟果實，采用高效液相色譜檢測番茄紅素的含量，由圖5可知，TePDS1轉(zhuǎn)基因果實中番茄紅素顯著高于野生型。結果表明萬壽菊類胡蘿卜素合成途徑基因TePDS1在番茄中表達，能夠增加番茄紅素的積累，驗證了TePDS1的功能活性。

3?討論

八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是植物中類胡蘿卜素生物合成代謝途徑中的關鍵酶，它可以將無色的八氫番茄紅素催化脫氫為9，9′-二順式-ζ-胡蘿卜素，之后由ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）和類胡蘿卜素異構酶（CRTISO）催化合成番茄紅素，由此再進一步生成下游的其他類胡蘿卜素[14-16]。PDS 位于類胡蘿卜素生物合成途徑的上游，是代謝途徑中的關鍵限速酶之一，影響整個代謝途徑的合成速度和產(chǎn)物水平。該研究從高色素含量植物材料萬壽菊中克隆TePDS1 基因，其編碼序列與向日葵、旋覆花、北野菊、萵苣、番木瓜、番茄、擬南芥、葡萄、水稻的同源性均為80%以上，表明不同植物來源PDS 具有保守的重要共同功能。

雖然類胡蘿卜素生物合成途徑在植物中保守存在，但不同植物物種中類胡蘿卜素的含量和成分組成有很大差異。葉黃素、胡蘿卜素、番茄紅素等類胡蘿卜素成分具有重要的營養(yǎng)作用，主要由膳食獲取或食物中添加。為驗證萬壽菊中TePDS1的功能和應用潛力，該研究通過遺傳轉(zhuǎn)化方法將萬壽菊中TePDS1基因整合于模式果蔬作物番茄中，轉(zhuǎn)基因植株主要農(nóng)藝表型未受明顯影響，但果實中番茄紅素含量顯著增加，表明來源于萬壽菊的TePDS1基因具有功能活性，可用于培育和篩選高色素植物材料。

目前，從對模式植物的研究中，已經(jīng)對類胡蘿卜素生物合成途徑主要過程步驟及其催化基因有了比較清晰的認識，也為應用基因工程技術改變農(nóng)作物的類胡蘿卜素成分和提高類胡蘿卜素含量奠定了基礎。但對于控制這一合成途徑的調(diào)控基因仍報道不多。在該研究中，通過轉(zhuǎn)入萬壽菊功能基因TePDS1，使番茄果實中番茄紅素增加，為提高植物果實色素營養(yǎng)品質(zhì)提供了新的基因資源和研究基礎。后續(xù)可進一步探討利用組學、生物學等方法鑒定分離萬壽菊色素合成調(diào)控基因，嘗試利用調(diào)控基因?qū)Ψ阎蓄惡}卜素生物合成途徑進行整體調(diào)節(jié)和遺傳改良。

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