許東亮， 彭朝暉， 劉濤△

1河南省人民醫(yī)院、鄭州大學人民醫(yī)院、河南大學人民醫(yī)院口腔醫(yī)學中心(河南鄭州 450003); 2中國平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院口腔科(河南平頂山 467000)

種植體周圍炎是由于口腔細菌微生物引發(fā)的種植體周圍硬軟組織的炎癥，臨床表現(xiàn)為探針出血、黏膜紅腫、溢膿等，若治療不及時，最終可能導致種植體松動脫落[1]。目前治療種植體周圍炎的方法是牙周基礎治療結合抗生素的使用，然而，種植體周圍炎疾病進展迅速，致炎因子引起的破骨細胞活化易導致牙槽骨吸收平衡遭到破壞，傳統(tǒng)治療方式對改善或逆轉牙槽骨吸收效果不明顯[2]。因此，在種植體周圍炎癥初期抑制破骨細胞活化，維持牙槽骨吸收與新生的平衡，對臨床治療種植體周圍炎具有十分重要的意義。然而種植體周圍炎與種植體齦溝液中生物學指標的關系仍有待進一步探究，研究表明，miR-23a在慢性炎癥反應中表達上調，與肝炎、牙周炎等炎性疾病有關[3]。miR-146a是炎癥因子信號傳導的重要物質，可能是導致牙周炎等慢性炎性疾病進展的重要因素[4]。但miR-23a、miR-146a與種植體周圍炎的關系，目前尚鮮有報道，基于此，本研究通過檢測種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a的水平，以期探討兩者與種植體周圍炎的關系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年6月至2017年12月于本院行牙種植修復，并進行術后12個月復查的189例患者為研究對象，其中男100例，女89例，年齡25～75歲，平均(49.15±16.70)歲，種植體265枚。根據臨床指標將患者分為：健康種植體組[探針深度(PD)≤3 mm，齦溝出血指數(SBI)≤2 ] 87例，其中男47例，女40例，年齡26～75歲，平均(49.91±16.70)歲，種植體109枚，炎癥種植體組(PD>3 mm，SBI>2)102例，其中男53例，女49例，年齡26～73歲，平均(47.85±16.83)歲，種植體156枚。納入標準：(1)口腔衛(wèi)生良好，首次進行種植牙修復術；(2)患者自愿配合本次研究，資料獲取完整；(3)患者均已簽署知情同意書。排除標準：(1)有慢性咽炎、扁桃體炎等相關炎癥疾??；(2)妊娠期、哺乳期婦女；(3)近期使用過抗生素、免疫制劑等藥物；(4)伴有全身系系統(tǒng)性疾病患者。

同期選取在本院參與體檢者78例作為對照組，男40例，女38例，年齡25～75歲，平均(50.12±16.35)歲，3組受試者性別、年齡等一般資料相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 齦溝液的采集 清水漱口，用無菌干棉球擦干牙面，隔濕進行取樣，探針去除菌斑，氣槍輕吹牙齦，將濾紙條(2 mm×20 mm)插入齦下約60 s，取出濾紙條，測量并記錄浸濕長度，并將浸濕部分剪入裝有100 μL生理鹽水的EP管中，每管含2條濾紙(同一樣本)，振蕩1 h，在4℃離心機(1 000 r/min)上離心10 min，取上清液，置于-70℃冰箱中保存待測。

1.2.2 齦溝液的定量 用微量加樣槍依次取人血清0.1～1.5 μL，分別滴在與1.2.1齦溝液采集同種規(guī)格的濾紙上，測量濾紙條浸濕長度，繪制濾紙條浸潤長度與血清量關系的標準曲線(Y=0.010 24+0.148 31X，R2=0.997 7，P=0.000)，計算齦溝液量(gingival cervical fluid，GCF)。

1.2.3 臨床指標測定 (1)PD：用牙簽探針檢查牙種植修復患者及正常人牙的近側、遠中頰側，近中、遠中舌側，4個位點的PD，記錄數據，并求取平均值。(2)檢查并記錄牙種植修復患者及正常人SBI，SBI評分標準：0：牙齦健康不出血，1：牙齦輕度炎癥，2：牙齦輕度炎癥，探診后點狀出血，3：牙齦中度炎癥，探診后血溢在齦溝內，4：牙齦重度炎癥，探診后血溢出齦溝，5：探診后牙齦出血或自動出血。

1.2.4 齦溝液中miR-23a、miR-146a水平檢測 采用qRT-PCR法檢測齦溝液中miR-23a、miR-146a水平，取齦溝液上清待測樣品，室溫解凍，采用miRNA提取試劑盒提取樣品總miRNA，采用反轉錄酶試劑盒將miRNA反轉錄成cDNA，采用qRT-PCR定量檢測血清中miR-23a、miR-146a水平，實驗過程參見試劑盒說明書，miRNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司，反轉錄酶試劑盒購自上海化科實驗器材有限公司，miScript SYBR Green PCR Kit購自上海力敏實業(yè)有限公司。反應體系20 μL，反應條件：95℃：15 s；95℃：50 s；60℃：15 s，共40個循環(huán)。每份樣品設3個重復。

miR-23a、miR-146a及內參U6的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法分析miR-23a、miR-146a的進行相對表達量。

表1 引物qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 3組受試者癥狀指標比較 炎癥種植體組PD、GCF、SBI均顯著高于對照組和健康種植體組(P<0.05)，健康種植體組PD、GCF、SBI與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

項目例數PD(mm)GCF(μL)SBI對照組782.53±0.450.70±0.240.65±0.23健康種植體組852.59±0.480.85±0.260.78±0.29炎癥種植體組1024.26±1.02?△1.91±0.60?△3.25±1.04?△F值169.509229.112438.533P值0.0000.0000.000

*與對照組比較P<0.05； △與健康種植體組比較P<0.05

2.2 3組受試者齦溝液中miR-23a、miR-146a水平比較 炎癥種植體組患者齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于對照組和健康種植體組(P<0.05)，健康種植體組患者齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表3。

項目例數miR-23a/U6miR-146a/U6對照組781.02±0.291.04±0.32健康種植體組851.88±0.56?2.21±0.75?炎癥種植體組1022.95±0.92?△3.87±1.17?△F值136.832181.214P值0.0000.000

*與對照組比較P<0.05；△與健康種植體組比較P<0.05

2.3 不同性別種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平比較 不同性別患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

>60歲組患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于<40歲組和40～60歲組(P<0.05)，40～60歲組患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與<40歲組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

項目例數miR-23a/U6miR-146a/U6男性532.92±0.863.81±1.07女性492.98±0.813.94±1.13t值0.3620.597P值0.7180.552

項目例數miR-23a/U6miR-146a/U6<40歲122.79±0.373.59±0.4540～60歲462.86±0.403.70±0.55>60歲443.10±0.49?△4.10±0.78?△F值4.3365.406P值0.0160.006

*與≤40歲組比較P<0.05；△與40～60歲組比較P<0.05

2.5 齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與各臨床指標的相關性 齦溝液中miR-23a水平均與患者PD、SBI呈正相關(P<0.05)，齦溝液中miR-146a水平均與患者PD、SBI呈正相關(P<0.05)，見表6。

表6 齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與各臨床指標的相關性分析

3 討論

種植體周圍炎是由多種因素引起的可逆炎癥反應，據臨床調查顯示，種植體周圍炎的發(fā)病率約為10%[5]，若治療不及時，則可能使種植體周圍支持組織喪失，形成種植體周圍袋，最終導致種植體脫落，種植術失敗[6]。其中引起種植體周圍炎的風險因素主要有三類：菌斑、宿主因素(牙周炎、糖尿病、吸煙)、醫(yī)源性因素(置入位置不佳、邊緣不密合)[7]。因此有效規(guī)避引起種植體周圍炎的危險因素，深入探究種植體齦溝液中相關生物學指標與種植體周圍炎臨床指標的關系，對提高種植體的成功率十分重要。

PD指牙周袋的深度，是重要的牙周臨床指標之一，在炎癥牙齦PD值通常高于健康牙齦，主要是因為測量時探針可穿透結合上皮，進入炎癥結締組織內，而健康牙齦探針尖端則終止于結合上皮。GCF是指通過溝內、結合上皮從牙齦結締組織滲入到齦溝內的液體，一般情況下齦溝液流出量與牙周炎癥程度成正比。SBI能夠反映出牙齦炎癥活動期的狀況，是常見的牙周炎癥臨床指標。謝謙等[8]研究表明PD、GCF、SBI均高于對照組和健康種植體組，本研究與謝謙等的研究結果一致，結果顯示，炎癥種植體組PD、GCF、SBI顯著高于對照組和健康種植體組，提示PD、GCF、SBI作為常見的牙周炎癥臨床指標能夠反映種植體周圍炎活動狀況及炎癥程度。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼的小分子RNA，長約22 nt，在各種生物體內表達廣泛，能夠參與細胞生長、分化、增殖與凋亡等生命過程，且在腫瘤疾病、內分泌疾病及炎癥疾病中表達異常[9]。miR-23包括2種亞型，miR-23a與miR-23b，其中miR-23a具有廣泛的基因調節(jié)功能[10]。李杰等[11]研究表明miR-23a在肺癌患者血清中表達上調。楊博等[12]研究表明miR-23a在炎癥性牙齦和牙槽骨組織中表達上調可能調節(jié)具有調節(jié)炎性微環(huán)境中骨組織的代謝及調節(jié)成骨細胞、牙周膜細胞生物學特性的作用。本研究結果顯示炎癥種植體組患者齦溝液中miR-23a水平顯著高于對照組和健康種植體組，健康種植體組患者齦溝液中miR-23a水平顯著高于對照組，提示炎癥種植體患者種植體齦溝液中miR-23a表達上調，miR-23a可能種植體周圍炎的發(fā)生有關。

miR-146包括2個亞型，即miR-146a與miR-146b，其中miR-146a可參與炎癥因子信號傳導過程，具有調控免疫細胞分化及免疫功能的作用[13]。研究表明miR-146a在炎性組織中表達上調，與炎癥反應的調節(jié)過程有關[14]。賀學農等[15]研究表明大鼠輕型腦創(chuàng)傷后，大鼠腦皮質中miR-146a表達顯著上調，在促進腦創(chuàng)傷后炎癥反應中發(fā)揮了重要作用。本研究結果顯示，炎癥種植體組患者齦溝液中miR-146a水平顯著高于對照組和健康種植體組，健康種植體組患者齦溝液中miR-146a水平顯著高于對照組，提示miR-146a可能與種植體炎癥反應的發(fā)生有關。

酈興[16]研究表明種植體周圍炎齦溝液中炎癥因子白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6及γ干擾素(IFN-γ)表達水平與種植體周圍炎患者性別無關，但與患者年齡有關。本研究結果顯示，不同性別患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平差異無統(tǒng)計學意義，但不同年齡段中，>60歲組患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于<40歲組及40～60歲組人群，提示患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與性別無關，但可能與患者年齡有關，分析造成此類現(xiàn)象的主要原因有：老年人免疫功能減退，機體免疫系統(tǒng)對于炎性因子的清除較弱，因此可能存在miR-23a、miR-146a水平較高的現(xiàn)象。本研究通過pearson相關性分析結果顯示齦溝液中miR-23a、miR-146a水平均與患者PD、SBI呈正相關，提示齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與種植體周圍炎患者牙周組織損傷的程度有關，可能反映種植體周圍組織的健康狀態(tài)。

綜上所述，在種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a表達上調，兩者與種植體周圍炎相關臨床指標有關，可能成為反映早期種植體周圍炎癥進展及牙周組織損傷程度的生物標志物。然而本研究樣本例數較少，下一步準備擴大樣本容量，繼續(xù)進行miR-23a、miR-146a與種植體周圍炎相關生物學機制等的研究。