張俊　李隱俠　錢勇　王慧利　孟春花　曹少先

摘要：為探討黑素皮質素受體4（MC4R）基因多態(tài)性對山羊體質量的影響，以波爾山羊為研究對象，采用池DNA為模板，PCR擴增MC4R基因，Sanger測序法篩選其在波爾山羊中的SNPs位點，PCR-RFLP方法進行多態(tài)位點分型，單因素方差分析不同基因型間波爾山羊各月齡體質量的差異。結果表明，編碼區(qū)502 bp處新檢測到A/G單堿基顛換，位于BseJⅠ酶切位點內，在波爾山羊群體中存在AA（0.779 1）、AG（0.202 5）和GG（0.018 4）3種基因型，關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)AA基因型個體初生體質量、1周齡體質量顯著高于AG基因型（P<0.05），1周齡體質量極顯著高于GG基因型（P<0.01），2周齡、2月齡、3月齡體質量顯著高于GG型（P<0.05）。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，A502G、C693T、A946C和C986T位點共存在8種不同的基因型組合，AACCAACC型個體初生體質量顯著高于AGCCAACC型（P<0.05），AACCAACT型個體周歲體質量顯著高于AACTACCC型和AGCTACCC型（P<0.05）。綜上所述，MC4R基因的A502G位點A基因對山羊早期體質量增加更有利，基因型組合AACCAACT對山羊周歲體質量增加更有利，可以作為山羊生長性狀選擇的候選分子標記。

關鍵詞：山羊;黑素皮質素受體4（MC4R）;多態(tài)性;體質量性狀;關聯(lián)性分析

中圖分類號： S827.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0053-04

收稿日期：2018-08-07

基金項目：江蘇省農業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（編號：PZCZ201740）;江蘇省肉羊產(chǎn)業(yè)技術體系崗位項目（編號：SXGC[2017]262）;國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD0501902-03）。

作者簡介：張 ?。?982—），女，江蘇南京人，助理研究員，主要從事羊分子育種研究。E-mail：applepuding@163.com。

通信作者：曹少先，博士，研究員，主要從事動物遺傳資源與育種研究。Tel：（025）84390352;E-mail：sxcao@jaas.ac.cn。

黑素皮質素受體-4（melanocortin receptor-4，MC4R）是動物下丘腦腹內側核分泌的一類肽類物質[1]，是黑素皮質素受體家族5個亞型之一，它屬于G蛋白偶聯(lián)受體超級家族，為跨膜神經(jīng)受體。在哺乳動物中，MC4R具有介導瘦素（leptin）的功能，是一個調節(jié)能量動態(tài)平衡的重要信號分子[2]。MC4R通過與其內源性配體黑素皮質素激素（melanocortin，MC）或刺鼠色蛋白（agouti protein，agouti蛋白）及其相關蛋白（agouti related protein，AGRP）相結合，從而在控制食欲和體質量穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[3-4]。1993年，Gantz等首次克隆出人MC4R基因，并用熒光標記原位雜交法將其定位于人18號染色體上[5]。1997年，Huszar等首次利用基因敲除試驗證明了MC4R基因缺失的小鼠出現(xiàn)肥胖、多食、胰島素分泌過多等癥狀，提出了MC4R基因在采食量和能量平衡中具有重要作用[6]。此后，又有研究發(fā)現(xiàn)，MC4R對豬、牛、兔等家畜的背膘厚、日增質量和采食量等有重要影響，可作為選擇動物生長性狀的候選遺傳標記。

張俊等的研究發(fā)現(xiàn)，波爾山羊MC4R基因存在C693T、A946C、C986T等3個多態(tài)性位點，其中在C693T、A946C處分別檢測到CC、CT和AA、AC各2種基因型，不同基因型波爾山羊體質量差異不顯著;C986T處檢測到CC、CT和TT等3種基因型，CT型的6月齡體質量和日增質量均極顯著高于CC型，CT型的周歲體質量和日增質量均顯著高于CC型，表明MC4R基因C986T位點可以作為山羊體質量性狀標記輔助選擇的候選分子標記[7-8]。

目前，關于山羊MC4R基因多態(tài)性及與其生長性狀關系的研究仍然較少，是否存在新的影響山羊生長性狀的MC4R位點，以及已發(fā)現(xiàn)的位點基因型組合是否影響生長性狀等均有待進一步研究。為此，本研究對山羊MC4R基因重新進行測序，尋找多態(tài)性位點，分析其多態(tài)性與山羊體質量性狀的關聯(lián)，聯(lián)合前期報道的3個位點，分析基因型組合與山羊體質量性狀的關聯(lián)，為山羊生長性狀的分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于本研究的163只波爾山羊及其體質量資料均由江蘇省農業(yè)科學院六合動物試驗基地提供。每只個體取耳組織樣于凍存管中，置冰桶中帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織DNA提取

采用酚-三氯甲烷抽提法提取組織樣DNA[9]，并溶于TE Buffer中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MC4R基因擴增

根據(jù)GenBank中山羊MC4R序列（NM_001285591.1）設計引物。上游引物序列為5′-TCCAAGTGATGCCGACCAG-3′，下游引物序列為5′-CTGGGCACTGCTTCACATC-3′，預期擴增片段1 375 bp。PCR反應總體系20 μL，包含模板DNA 60 ng、10×緩沖液 2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.4 突變位點測序篩選

將40只波爾山羊隨機分成4組（n=10），每組10只個體的DNA等量混合構建DNA池，每個DNA池取60 ng為模板進行MC4R基因PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用寶生物工程（大連）有限公司試劑盒切膠回收純化后，送上海英駿生物技術公司測序。

1.5 PCR-RFLP分析

1.5.1 MC4R基因片段的擴增 根據(jù)測序結果，設計1對引物擴增MC4R基因758 bp片段（NM_001285591.1，序列 379～1 136 bp），該片段包含A502G突變位點，基因型A位于BseJⅠ識別序列內。上游引物序列為5′-[JP9]AATCCAAGATGAACTCTACCCA-3′，下游引物序列為5′-[JP9]CAGGATGGTCAGCGTGAT-3′。PCR反應總體系為20 μL，含模板DNA 60 ng、10×緩沖液 2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色檢測擴增結果。

1.5.2 基因型的確定 采用BseJⅠ對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切。酶切反應體系16 μL，含PCR產(chǎn)物5 μL、BseJⅠ（10 U/μL）0.5 μL、10×緩沖液1.6 μL、滅菌雙蒸水8.9 μL，37 ℃酶切3 h。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，EB染色，培清JS-780全自動凝膠成像分析儀進行成像分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件one-way ANOVA分析基因型、基因型組合間波爾山羊各月齡體質量差異。各月齡體質量以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 MC4R基因的擴增

對4組波爾山羊池DNA模板分別進行MC4R基因PCR擴增，在1 400 bp左右得到1條特異性條帶（圖1），與預期結果一致。

2.2 測序篩選多態(tài)位點

以4組波爾山羊池DNA為模板擴增得到的MC4R基因純化后進行測序，新發(fā)現(xiàn)502 bp處A/G單堿基顛換（圖2）?；蛐虯位于BseJⅠ識別序列內。

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進行PCR擴增，在750 bp附近得到1條特異性條帶（圖3），與預期結果一致。采用限制性內切酶BseJⅠ對PCR擴增產(chǎn)物進行消化，出現(xiàn)3種基因型，分別命名為GG、AG、AA基因型。GG基因型得到758 bp 1個片段（圖4，泳道9）;AG基因型得到758、513、245 bp 3個片段（圖4，泳道4、5、14），AA基因型得到513、245 bp 2個片段（圖4，泳道1、2、3、6、7、8、10、11、12、13、15、16）。

2.4 基因和基因型頻率在受試羊群中的分布

在163只受試波爾山羊中，共檢測出3種基因型，AA型居多，占77.91%，AG型次之，占20.25%，GG型最少，占 1.84%（表1）;A基因頻率占88.1%，為優(yōu)勢基因。

2.5 A502G位點的效應分析

由表2可知，在受檢的波爾山羊群體中，AA基因型個體初生體質量、1周齡體質量顯著高于AG基因型，1周齡體質量極顯著高于GG基因型，2周齡、2月齡、3月齡體質量顯著高于GG型，其他月齡體質量差異不顯著。

2.6 MC4R基因4個位點的聚合效應分析

在受試波爾山羊中，A502G、C693T、A946C、C986T位點共存在8種不同的基因型組合，分別為AACCAACC型、AACCAACT型、AACTACCC型、AACTACTT型、AGCCAACC型、AGCCAACT型、AGCTACCC型和GGCCAACC型，其中聚合基因型AACTACTT型、AGCCAACT型和GGCCAACC型樣本少于3個，不參與分析。由表3可知，AACCAACC型個體初生體質量顯著高于AGCCAACC型，AACCAACT型個體周歲體質量顯著高于AACTACCC型和AGCTACCC型，其余指標間無顯著差異。

3 討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調控中起關鍵作用。人MC4R基因的突變可導致早期遺傳性肥胖[10-11]，豬、兔、雞、牛、犬等均已發(fā)現(xiàn)MC4R基因存在于與體質量性狀相關的SNPs。如Kim等對數(shù)個豬品系的研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因第7跨膜功能域的1個G/A突變可引起豬膘厚、體質量和采食量的顯著變化[12-14]。El-Sabrout等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因突變對兔體質量有顯著影響[15-17]。仇雪梅等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因5′調控區(qū)和編碼區(qū)上的4個突變對雞的體質量、屠體性狀有顯著影響[18]。Cai等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因C1069G突變顯著影響18月齡牦牛的體質量和日增質量[19]。Song等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因3′調控區(qū)的4個突變與湖羊45 d斷奶體質量顯著相關[20]。張軼博等研究發(fā)現(xiàn)，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體質量顯著相關[21]。目前，關于山羊MC4R基因多態(tài)性及與其生長性狀關系的研究仍然較少，是否存在新的影響山羊生長性狀的MC4R位點及基因型組合有待進一步研究。

本研究設計特異引物擴增波爾山羊MC4R基因序列，通過DNA池為模板PCR擴增MC4R基因，結合測序法篩選其在波爾山羊群體中的SNPs位點，在編碼區(qū)中新檢測到A502G單堿基顛換，且在波爾山羊群體中發(fā)現(xiàn)該位點存在3種基因型，將其與波爾山羊的體質量性狀進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AA基因型個體初生體質量、1周齡體質量顯著高于AG基因型（P<0.05），1周齡體質量極顯著高于GG基因型（P<0.01），2周齡、2月齡、3月齡體質量顯著高于GG型（P<0.05），說明A基因對體質量的增加更有利。該單堿基顛換導致MC4R氨基酸序列1 168 V（異亮氨酸→纈氨酸）變化，推測可能影響MC4R蛋白功能，從而引起體質量表型變化。

研究表明，生長性狀是由多基因控制的且存在互作作用，單個遺傳標記效應相對較小，不同位點的聚合效應分析將更有利于提高標記輔助選擇改良畜禽生產(chǎn)性能的效果。Wang等的研究發(fā)現(xiàn)，湖羊MC4R基因H1H3基因型組合的生產(chǎn)性能均高于其他基因型組合[22]。趙憲林等研究發(fā)現(xiàn)，藏羊MC4R基因H13H7雙倍型的各個生長性狀表現(xiàn)最優(yōu)[23]。黃毅研究發(fā)現(xiàn)，鵝MC4R基因H3H3基因型組合的活質量、屠體質量、半凈膛質量、胸肌質量與H4H4基因型組合的肝質量、肝體比、肝屠比和腹脂率顯著高于其他基因型組合[24]。唐現(xiàn)文研究發(fā)現(xiàn)，黑羽番鴨MC4R基因的C645T和G672A等2處基因型組合對公鴨活體質量和屠宰性能均有顯著影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，山羊MC4R基因C693T、A946C、C986T、A502G等4個位點在受檢波爾山羊群體中存在8種基因型組合。單因素方差分析表明，AACCAACC型個體初生質量顯著高于AGCCAACC型，AACCAACT型個體周歲體質量顯著高于AACTACCC型和AGCTACCC型，其余指標間無顯著差異。由于AACTACTT型、AGCCAACT型和GGCCAACC型樣本少于3個，無法進行差異顯著性分析，因此還須擴大樣本數(shù)，進一步研究這些基因型組合與生產(chǎn)性能的關聯(lián)性，以全面了解不同基因型組合的效應，為更好地利用基因型組合進行生長性狀的輔助選擇奠定基礎。

4 結論

MC4R基因是畜禽經(jīng)濟性狀的重要候選基因，在哺乳動物的體質量和體長調控中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)MC4R基因的A502G位點A基因對山羊早期體質量增加更有利，基因型組合AACCAACT對山羊周歲體質量增加更有利，可以作為山羊生長性狀選擇的候選分子標記。

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