曹丁　李學優(yōu)　昝繼清　蘭玲峰　甘祥武

摘要：旨在利用畢赤酵母密碼子的偏好性和遺傳簡并性，將雞α干擾素優(yōu)化基因片段cIFN-α[STBX]2[STBZ]連入畢赤酵母表達載體pPIC9k，再經(jīng)重疊延伸PCR方法去除重組質(zhì)粒的5′端非翻譯區(qū)多余的8個核苷酸GGATCCAA，使其與畢赤酵母AOX1（醇氧化酶）的5′端非翻譯區(qū)的序列完全一致，構建并篩選重組畢赤酵母，并進行搖瓶誘導表達試驗。將表達產(chǎn)物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行檢測，并用微量病變抑制法檢測其抗病毒效價?？共《净钚詸z測結果顯示，天然基因、優(yōu)化基因、質(zhì)粒5′端非翻譯區(qū)改造后的優(yōu)化基因重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物的抗病毒效價分別為105、106、1.5×106 U/mL。雞α干擾素基因優(yōu)化后的抗病毒效價提高了10倍，對質(zhì)粒5′端非翻譯區(qū)進行進一步改造后，表達蛋白的抗病毒活性提高了50%，從而為雞α干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

關鍵詞：雞α干擾素;真核表達;pPIC9k;分泌表達;抗病毒活性

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0068-04

收稿日期：2018-09-16

基金項目：廣州市科技計劃（編號：201610010087）。

作者簡介：曹 丁（1986—），女，河南南陽人，碩士，高級工程師，主要從事生物農(nóng)業(yè)工程方面的研究。E-mail：caoding218@163.com。

干擾素是一類能夠誘導人及動物細胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學活性，可有效解決禽類的疫病泛濫問題，并能夠解決應用抗生素造成的菌群失調(diào)、出現(xiàn)耐藥性菌株及藥物的不良反應等問題[1-2]。畢赤酵母是近年來發(fā)展起來的一種以甲醇為碳源的真核表達系統(tǒng)，酵母可對異源蛋白進行修飾，采用有信號肽的質(zhì)粒時，蛋白能被正確折疊和加工，然后被分泌到培養(yǎng)基中。畢赤酵母分泌蛋白除了具有與哺乳動物細胞表達蛋白許多相似的優(yōu)點外，還具有操作簡便、營養(yǎng)要求低、培養(yǎng)價格低廉、便于高密度發(fā)酵、高產(chǎn)分泌表達外源蛋白以及表達產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點[3-4]。因此，基于畢赤酵母的表達系統(tǒng)，可以有效地高表達重組雞α干擾素。

雞α干擾素作為禽類干擾素中的代表，其抗病毒作用較強。本研究為了解決天然雞α干擾素基因表達量低下等問題，在其成熟肽序列的基礎上，選用畢赤酵母偏好性密碼子，人工合成其優(yōu)化基因序列，并在基因序列前加入蛋白酶切割位點，使其表達蛋白具有天然的N端。此外，將連入的真核表達載體pPIC9k的5′端非翻譯區(qū)（5′UTR）序列進行改造，去除多余的8個堿基序列，使其與畢赤酵母AOX1（醇氧化酶）的mRNA序列完全一致，并初步研究了改造載體在畢赤酵母SMD1168中的表達和抗病毒活性，以期提高雞α干擾素的表達水平，解決其在工業(yè)生產(chǎn)中的瓶頸問題。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和質(zhì)粒

pPIC9k質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、畢赤酵母SMD1168和水泡性口炎病毒（VSV），均由廣東省微生物種質(zhì)資源庫保存。

1.2 主要試劑

PFU（高保真DNA聚合酶） Mix、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、引物、核酸染色劑、瓊脂糖，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、G418、DNA marker、蛋白質(zhì)marker，購自TaKaRa公司;酵母抽提物、胰蛋白胨，購自英國Oxoid公司;瓊脂粉，購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設備

主要儀器與設備有生化培養(yǎng)箱、DHZ-DA大容量全溫振蕩器、752N型紫外可見分光光度計、PCR儀、恒溫金屬浴、水平/垂直電泳儀、藍光切膠儀、顯微鏡、電子天平、pH值等。

1.4 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的雞α干擾素成熟肽序列，同時遵循畢赤酵母密碼子使用的偏好性和遺傳簡并性原則，選用畢赤酵母的偏愛密碼子[5]，用Primer 5.0軟件設計12條引物P1～P12，運用重疊延伸PCR方法人工合成cIFN-α基因序列[6]。插入畢赤酵母表達載體pPIC9k，在5′端起始密碼子前選擇酶切位點EcoR Ⅰ，在3′端終止密碼子后選擇酶切位點Not Ⅰ，在目的基因前面加入kex2、Ste13蛋白酶裂解位點，使外源基因表達產(chǎn)物具有天然的N端，并利用載體上的α信號肽序列得到分泌表達。

1.5 雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因序列的SOE（重疊延伸基因擴增技術）

取引物P1～P4（10 μmol/L）各2 μL，PFU Mix 25 μL，用雙蒸水補至50 μL，PCR反應程序如下：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s）×30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。每組分別以P1～P4引物為第1組，P5～P8引物為第2組，P9～P12引物為第3組，按相同條件進行PCR擴增，將反應產(chǎn)物分別在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，將回收產(chǎn)物分別標記為D1、D2、D3。

取D1、D2、D3各2 μL，引物P1、P12各1 μL，PFU Mix 25 μL，補充雙蒸水至總體積為50 μL，PCR反應程序如下：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s）×30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。將反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收，該回收產(chǎn)物即為擴增的雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因序列，標記為cIFN-α[STBX]2[STBZ]，雞α干擾素成熟肽天然基因標記為cIFN-α[STBX]1[STBZ]。

1.6 cIFN-α重組表達載體的構建

將cIFN-α2基因片段和pPIC9k質(zhì)粒分別進行EcoR Ⅰ、Not Ⅰ雙酶切后連接，轉化大腸桿菌DH5α，構建表達載體pPIC9k-cIFN-α2。將轉化菌落經(jīng)菌落PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

1.7 pPIC9k-cIFN-α2的5′非翻譯區(qū)的改造

將pPIC9k表達載體的非翻譯區(qū)序列與畢赤酵母全基因序列中的AOX1基因序列進行比較，發(fā)現(xiàn)pPIC9k質(zhì)粒的5′非翻譯區(qū)多出了8個核苷酸序列GGATCCAA，本試驗通過設計4條引物，應用PCR方法擬去除表達重組載體信號肽mRNA 5′-UTR序列中的GGATCCAA序列[7]。首先在載體上改造位點（GGATCCAA）的上游找到Sac Ⅰ酶切位點，在目的基因下游找到Not Ⅰ酶切位點，設計3條引物E1、E2、E3，其中E1含有酶切位點Sac Ⅰ，E2、E3有互補序列，且內(nèi)部人為去除GGATCCAA序列，分別以E1、E2以及E3、P12為引物，以pPIC9k-cIFN-αR質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，可擴增得到長度分別為732、824 bp左右的片段A、B。再將片段A、B進行切膠回收后，用引物E1、P12利用重疊延伸PCR方法擴增得到片段C，大小為1 532 bp。將片段C回收后與pPIC9k質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ、NotⅠ雙酶切后連接，即得到重組5′UTR區(qū)改造質(zhì)粒pPIC9k-cIFN-αR，進一步進行序列測定以驗證結果。最終實現(xiàn)去掉5′-UTR多余的8個堿基，使得經(jīng)過改造的質(zhì)粒pPIC9k的5′-UTR與酵母基因組的AOX1完全相同，從而降低了可能引起的表達量降低或者不表達的可能性。

1.8 重組質(zhì)粒轉化SMD1168的篩選和鑒定

將重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ進行單酶切后，電擊轉化畢赤酵母SMD1168，將轉化后的酵母細胞涂布于MD（最小葡萄糖培養(yǎng)基）平板進行培養(yǎng)，直至長出單菌落。挑選轉化子菌落，用裂解液進行PCR模板的制備，用通用引物α-factor、3′AOX進行PCR擴增，將篩選到的陽性轉化子經(jīng)濃度逐漸增高的G418抗生素篩選高拷貝克隆，用于表達目的蛋白。

1.9 雞α干擾素的誘導表達及檢測

選取耐受2.0 mg/mL G418抗生素濃度的單菌落，每種重組質(zhì)粒各選取3個，以pPIC9k空質(zhì)粒轉化酵母作為陰性對照。將畢赤酵母從活化平板接種至YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基）搖瓶，于28 ℃、220 r/min 培養(yǎng)24 h，從YPD搖瓶中按1%的接種量接至BMGY（最小甘油緩沖液培養(yǎng)基）搖瓶中，于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h，4 000 r/min離心10 min取沉淀;用等體積的BMMY（最小甲醇緩沖液培養(yǎng)基）培養(yǎng)基重新懸浮菌體，于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后，補加1%甲醇和磷酸鉀溶液1次，48 h后結束培養(yǎng)。將BMMY搖瓶菌液于12 000 r/min離心10 min，取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，對過濾上清進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和抗病毒活性檢測。

1.10 重組雞α干擾素的抗病毒活性檢測

采用微量細胞病變抑制法[8]測定重組雞α干擾素的抗病毒活性，具體步驟如下：取孵化9～10 d的SPF（無特定病原體）雞胚，去頭、四肢及內(nèi)臟，在無菌狀態(tài)下用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3遍后，剪碎，用0.25%胰酶于37 ℃消化后，再用無血清營養(yǎng)液洗去胰酶，并用大孔吸管吹打成單個細胞后上96孔板，生長約12 h使細胞全部貼壁生長至單層后，去除生長液。每孔加入10倍倍比稀釋的干擾素（用無血清營養(yǎng)液稀釋）共 100 μL，每個稀釋度設6孔平行樣，孵育12 h后用100 TCID50劑量的水泡性口炎病毒進行攻毒，同時設陽性對照孔（不加干擾素，只加病毒）、陰性對照孔（只加干擾素，不加病毒）、空白對照孔（不加干擾素，不加病毒），大約12～24 h后在倒置顯微鏡下觀察結果。當陽性對照孔出現(xiàn)75%以上病變時，判斷結果，以能抑制50%細胞病變的樣品干擾素稀釋度定義為1個單位干擾素。

2 結果與分析

2.1 雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的擴增及重組表達質(zhì)粒的構建

PCR擴增后的cIFN-α2基因產(chǎn)物片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)有1條清晰的條帶（圖1-a），預期大小為 696 bp，與DNA marker相比，大小與預期相符，回收后測序表明，序列正確，與設計相符合。

將cIFN-α2基因片段雙酶切后連入pPIC9k表達載體，用通用引物α-factor、3′AOX進行菌落PCR篩選陽性克隆，將擴增條帶進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果有明顯條帶被擴增出來，與DNA marker比對可知，位于750 bp附近。擴增出來的片段預計大小為696 bp，與PCR檢測的結果基本相符。選擇3個陽性克隆保種、提質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，結果表明，載體連入序列正確，得到含雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的pPIC9k表達載體。

2.2 pPIC9k-cIFN-α2的5′非翻譯區(qū)的改造

將擴增后的A、B、C片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在目標位置均有1條清晰的條帶，經(jīng)檢測，大小正確，說明擴增成功（圖2-a）。用通用引物對pPIC9k-cIFN-α2啟動子改建轉化子的菌落PCR結果顯示，擴增有明顯條帶（圖2-b），與DNA marker相比，位于1 600 bp附近。由于鑒定PCR中采用的是E1、3′AOX引物，因此擴增出來的片段大小應該是1 532 bp，與PCR檢測的結果基本相符（圖2-a）。選擇3個陽性克隆保種、提質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，結果表明，載體連入序列正確，得到含有雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的5′UTR區(qū)改造質(zhì)粒pPIC9k-cIFN-α2-E。

2.3 重組畢赤酵母的鑒定

將重組畢赤酵母菌株用通用引物α-factor、3′AOX進行酵母菌落PCR驗證，如圖3所示，篩選到的重組畢赤酵母在目標位置出現(xiàn)了明顯條帶，與預期的696 bp一致，證明線性化的重組質(zhì)粒已經(jīng)被成功整合至畢赤酵母基因組中。

2.4 雞α干擾素的表達檢測

對篩選到的高拷貝陽性畢赤酵母重組子SMD1168-pPIC9k-cIFN-α1、SMD1168-pPIC9k-cIFN-α2、SMD1168-pPIC9k-cIFN-α2-E進行搖瓶誘導表達試驗，分別取48 h表達上清進行12%SDS-PAGE。由圖4可以看出，在20 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶，與預期分子量大小19 ku基本相符，而陰性對照未重組的SMD1168與空質(zhì)粒轉化對照SMD1168-pPIC9k未出現(xiàn)相應條帶。光密度掃描結果顯示，雞α干擾素優(yōu)化基因重組酵母的蛋白表達量大于天然基因重組酵母SMD1168-pPIC9k-cIFN-α1。

2.5 重組酵母表達雞α干擾素抗病毒活性的測定

病毒抑制法測定酵母表達產(chǎn)物的抗病毒活性結果顯示，攻毒24 h后觀察到陽性對照孔出現(xiàn)100%的病變，陰性對照孔中是正常的雞胚成纖維細胞。從表1可以看出，雞α干擾素基因的優(yōu)化可以提高其表達水平，抗病毒效價明顯提高了

10倍;在優(yōu)化基因重組畢赤酵母的基礎上，對質(zhì)粒5′端非翻譯區(qū)進行進一步改造后，表達蛋白的抗病毒活性提高了約50%。

3 討論與結論

研究表明，mRNA的5′端非翻譯區(qū)序列組成和長度可影響翻譯效率，畢赤酵母是1種甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠以甲醇為唯一碳源生長[9]。與甲醇代謝相關的醇氧化酶AOX1基因受甲醇的嚴格調(diào)控并啟動高效表達，醇氧化酶占細胞可溶性蛋白的35%，而對應的mRNA僅僅占總mRNA的5%以下[10]，說明醇氧化酶mRNA的翻譯效率極高，其5′端非翻譯區(qū)有利于目的蛋白在畢赤酵母中的表達。

Sreekrishna等通過改建人血清蛋白mRNA，使其與甲醇氧化酶基因AOX1 mRNA的5′UTR相同，結果發(fā)現(xiàn)，其表達水平提高了50倍以上[11]，說明AOX1的5′UTR對目的基因表達水平的影響比較大，具有相同的5′UTR有利于目的基因在畢赤酵母中的表達翻譯，而pPIC9k質(zhì)粒的5′UTR與AOX1的5′UTR的序列相比，多了8個堿基GGATCCAA，這可能成為限制目的蛋白表達的重要因素之一。

近年來的多數(shù)研究表明，由于不同物種對同義密碼子的使用頻率不同，外源基因，尤其是來自較遠物種的基因在宿主中的表達會受到一定影響，通過對外源基因的密碼子進行優(yōu)化，可以提高其表達水平[12]。本研究運用PCR方法，將pPIC9k質(zhì)粒5′UTR的8個核苷酸序列去除，使其與AOX1 的5′UTR序列相同，并對其雞α干擾素的密碼子進行了優(yōu)化，將獲得的重組菌株在搖瓶水平進行了甲醇誘導表達。檢測結果表明，與天然基因相比，密碼子優(yōu)化后的雞α干擾素重組酵母菌株的表達量得到了提高，抗病毒活性提高了10倍，在此基礎上，對pPIC9k質(zhì)粒的5′UTR進行改造后，抗病毒活性提高了50%，說明其mRNA的5′非翻譯區(qū)的改造能有效提高雞α干擾素在畢赤酵母中的表達。本研究為提高雞α干擾素的工程菌表達效果提供了新的思路。

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