外源茉莉酸甲酯對(duì)牛樟芝產(chǎn)總?cè)萍岸嗵呛康挠绊?/h1>
2019-12-16 01:42張知曉季梅劉凌戶連榮
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年19期 關(guān)鍵詞：多糖
張知曉 季梅 劉凌 戶連榮
摘要：為了探討茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)牛樟芝（Antrodia camphorata）發(fā)酵產(chǎn)三萜及多糖的影響及Ca2+對(duì)MeJA的誘導(dǎo)作用，向牛樟芝發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入MeJA溶液，設(shè)置不同添加濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）、不同時(shí)間（0、2、4、6、8 d）、不同溶劑3組試驗(yàn)，培養(yǎng)后檢測(cè)牛樟芝生物量、三萜、胞外多糖及胞內(nèi)多糖的含量，并同樣測(cè)試添加CaCl2的效果。結(jié)果表明，用MeJA處理牛樟芝，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)總?cè)?、多糖具有積極的促進(jìn)作用，并且于培養(yǎng)4 d時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加用吐溫-80溶解的50 μmol/L MeJA溶液，促進(jìn)作用最佳。此外，在添加MeJA的同時(shí)添加CaCl2的處理較僅添加MeJA的處理的牛樟芝生物量、三萜、胞外多糖及胞內(nèi)多糖含量顯著增加。
關(guān)鍵詞：牛樟芝;MeJA;Ca2+;總?cè)?多糖
中圖分類號(hào)： S646.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0133-04
收稿日期：2019-01-03
基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目青年項(xiàng)目（編號(hào)：2016FD096）。
作者簡(jiǎn)介：張知曉（1988—），女，云南個(gè)舊人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樯治⑸镔Y源的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：36062613@qq.com。
通信作者：戶連榮，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樯稚鷳B(tài)保護(hù)與研究。E-mail：444387051@qq.com。
牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、樟生薄孔菌等，是分屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌屬（Antrodia）的珍稀藥用真菌[1]，被譽(yù)為“森林中的紅寶石”[2]。牛樟芝中的三萜類物質(zhì)是其最主要的1種藥用化學(xué)成分，可以起到保肝護(hù)肝、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、降血壓、抗炎癥的作用，且牛樟芝中三萜類化合物的含量和種類都是靈芝的數(shù)倍，樟芝三萜也因此成為開(kāi)發(fā)樟芝的研究重點(diǎn)之一[3]。此外，樟芝中含有的多糖對(duì)人體起到提高免疫力、抑制病毒的作用，對(duì)保護(hù)肝臟也有一定的效果[4]。
茉莉酸甲酯（MeJA）是一種脂肪酸衍生物，在植物中起著信號(hào)傳遞的作用，同時(shí)能夠明顯促進(jìn)植物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物[5]。已有研究表明，將MeJA作為誘導(dǎo)劑添加到靈芝（Ganoderma lucidum）和樺褐孔菌（Inonotus obliquus）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后的三萜產(chǎn)量均較對(duì)照有明顯提高[6-7]。而在這方面，關(guān)于同屬多孔菌目牛樟芝的研究還未見(jiàn)報(bào)道。此外，鈣（Ca）是生物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與構(gòu)成生物組織，調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)發(fā)育，參與調(diào)控植物抗逆等生理反應(yīng)[8]。已有部分研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+參與MeJA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，如馬泓思等發(fā)現(xiàn)，外源Ca2+離子能進(jìn)一步增強(qiáng)MeJA 誘導(dǎo)的白樺（Betula platyphylla）細(xì)胞懸浮液合成三萜類物質(zhì)的效果[9]。而關(guān)于Ca2+促進(jìn)MeJA誘導(dǎo)真菌合成三萜類物質(zhì)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。基于牛樟芝中的三萜、多糖具有極高的藥用價(jià)值，本研究以牛樟芝為試驗(yàn)材料，研究MeJA對(duì)牛樟芝2種藥用成分的影響及Ca2+處理對(duì)MeJA作用的影響，以期初步探明1種增加牛樟芝三萜及多糖產(chǎn)量的方法。
1 材料與方法
1.1 供試材料
本研究所用菌種為從中國(guó)臺(tái)灣引進(jìn)的牛樟芝優(yōu)良菌株。
1.1.1 培養(yǎng)基和菌株培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：25 g葡萄糖，5 g蛋白胨，3 g麥芽糖，3 g酵母提取物，1 g KH2PO4，1 g MgSO4，1 g維生素B1，1 L水，pH值5.5。
孢子懸浮液的制備方法：取已培養(yǎng)20d的牛樟芝培養(yǎng)皿，用20 mL無(wú)菌水洗下培養(yǎng)皿表面的孢子備用。
基礎(chǔ)培養(yǎng)方法：在500 mL三角瓶中裝100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接入1 mL牛樟芝孢子懸浮液，搖床上于100 r/min、26 ℃恒溫培養(yǎng)12 d后，收集菌絲。
1.1.2 主要試劑 茉莉酸甲酯，購(gòu)于Sigma公司;齊墩果酸及其他試劑，購(gòu)于昆明騰科科技有限公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 本試驗(yàn)于2018年3—7月在云南省林業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
1.2.2 樣品處理 （1）將MeJA用無(wú)水乙醇配制成終濃度為25、50、75、100、200 μmol/L的溶液。采用0.2 μm的無(wú)菌針頭式過(guò)濾器過(guò)濾進(jìn)行滅菌處理后，在基礎(chǔ)搖瓶發(fā)酵方法的基礎(chǔ)上，于4 d后添加到培養(yǎng)基中，添加量為2 μL/mL，搖床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析其生物量、總?cè)屏俊麅?nèi)多糖和胞外多糖量。
（2）將MeJA用無(wú)水乙醇配制成終濃度為50 μmol/L的溶液。于不同培養(yǎng)時(shí)間（培養(yǎng)0、2、4、6、8d）添加到培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析。
（3）以無(wú)水乙醇、吐溫-20、吐溫-80作為助溶劑，將MeJA配制成終濃度為50 μmol/L的溶液，于4 d后添加到培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析，篩選出MeJA的最佳添加方案。
在MeJA最佳添加方案的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中同時(shí)添加CaCl2，使CaCl2的終濃度為75 nmol/L。另外設(shè)置2組對(duì)照組，分別僅向培養(yǎng)基中添加MeJA、CaCl2。設(shè)3組獨(dú)立試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析其生物量、總?cè)屏俊麅?nèi)多糖和胞外多糖量。
1.2.3 生物量的測(cè)定 生物量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]。通過(guò)抽濾分離發(fā)酵液與菌絲體，菌絲體用蒸餾水反復(fù)沖洗至洗液變?yōu)闊o(wú)色，置于干燥箱中，于70 ℃烘干至恒質(zhì)量，對(duì)干燥菌絲體用精度為0.001 g的電子天平稱量，即得菌絲體生物量。
1.2.4 菌絲體內(nèi)總?cè)坪康臏y(cè)定 采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色體系對(duì)總?cè)坪窟M(jìn)行測(cè)定。具體步驟參考楊彬君等的方法[11]。
1.2.5 胞外多糖含量的測(cè)定 胞外多糖含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[12]。將發(fā)酵液（用濾紙）過(guò)濾，取100 mL濾液在 60 ℃ 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使濾液濃縮至原體積的1/3，加3倍體積的無(wú)水乙醇靜置沉淀24 h，4 000 r/min離心分離15 min，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇輕輕沖洗后，用烘箱于50 ℃烘干至恒質(zhì)量，得到胞外粗多糖。
1.2.6 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13]。將菌絲體用烘箱烘干至恒質(zhì)量，研磨過(guò)篩，置于圓底燒瓶中，加30倍體積的水，于80 ℃水浴1 h，水浴提取后，再用超聲波提取30 min，重復(fù)2次提取多糖，合并提取液，離心、過(guò)濾，濾液用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和數(shù)理分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 MeJA不同添加濃度對(duì)牛樟芝發(fā)酵特性的影響
MeJA不同添加濃度對(duì)牛樟芝生物量及三萜含量的影響如圖1-a所示，可見(jiàn)當(dāng)MeJA添加濃度為25 μmol/L時(shí)，1L發(fā)酵液中的牛樟芝生物量達(dá)9.46 g;當(dāng)MeJA添加濃度為50 μmol/L 時(shí)，牛樟芝的生物量達(dá)9.25 g/L，與MeJA添加濃度為25 μmol/L處理間的生物量無(wú)顯著差異;當(dāng)MeJA添加濃度為0 μmol/L時(shí)，牛樟芝的生物量較MeJA添加濃度為 25 μmol/L 時(shí)降低了2.55 g/L，但顯著高于MeJA添加濃度為100、200 μmol/L時(shí)的生物量。三萜含量在MeJA添加濃度為50 μmol/L時(shí)最高（14.21 mg/g），其次為MeJA添加濃度為25、100 μmol/L的處理，當(dāng)MeJA添加濃度為0、200 μmol/L時(shí)，三萜含量最低。
MeJA不同添加濃度對(duì)牛樟芝胞外多糖及胞內(nèi)多糖含量的影響如圖1-b所示，可見(jiàn)當(dāng)MeJA添加濃度為50 μmol/L時(shí)，牛樟芝胞外多糖、胞內(nèi)多糖含量均最高，分別為 10.27 g/L、11.5mg/g;當(dāng)MeJA添加濃度為0、200 μmol/L時(shí)，胞外多糖含量均較低，二者間無(wú)顯著差異，而當(dāng)胞內(nèi)多糖含量最低時(shí)，對(duì)應(yīng)的MeJA添加濃度為200 μmol/L。
2.2 MeJA不同添加時(shí)間對(duì)牛樟芝發(fā)酵特性的影響
MeJA不同添加時(shí)間對(duì)牛樟芝生物量及三萜含量的影響如圖2-a所示，可以看出，于培養(yǎng)4 d時(shí)添加MeJA發(fā)酵的牛樟芝生物量顯著高于其他時(shí)間的生物量，為12.04 g/L，而于培養(yǎng)8 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的生物量最低，僅為7.11 g/L。于培養(yǎng)0、2、4 d時(shí)添加MeJA的三萜含量分別為15.48、15.12、16.42 mg/g，三者間無(wú)顯著差異，但顯著高于其他試驗(yàn)組。
MeJA不同添加時(shí)間對(duì)牛樟芝胞外多糖及胞內(nèi)多糖含量的影響如圖2-b所示，可以看出，于培養(yǎng)4 d時(shí)添加MeJA發(fā)酵的胞外多糖含量最高，達(dá)15.18 g/L，于培養(yǎng)6、8 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的胞外多糖含量較低，分別較培養(yǎng)4 d時(shí)降低了53%、60%。同樣，于培養(yǎng)4 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的胞內(nèi)多糖含量最高（12.2 mg/g），其次是培養(yǎng)2 d時(shí)添加MeJA的胞內(nèi)多糖含量，二者間無(wú)顯著差異， 于培養(yǎng)8 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的胞內(nèi)多糖含量最低，僅為6.4 mg/g。
2.3 MeJA不同溶劑對(duì)牛樟芝發(fā)酵特性的影響
由表1可以看出，以吐溫-80為溶劑的MeJA溶液對(duì)牛樟芝發(fā)酵后生物量的促進(jìn)作用最佳，生物量達(dá)到8.25 g/L，單獨(dú)添加吐溫-80溶液的效果次之;以無(wú)水乙醇為溶劑的MeJA溶液處理的生物量為6.16 g/L，單獨(dú)添加無(wú)水乙醇溶液的生物量為3.48 g/L;以吐溫-20為溶劑的MeJA溶液和單獨(dú)添加吐溫-20的溶液發(fā)酵的牛樟芝生物量均為0 g/L。幾組處理的三萜含量排序如下：添加MeJA（無(wú)水乙醇）溶液≥添加MeJA（吐溫-80）溶液>吐溫-80≥無(wú)水乙醇。
比較胞內(nèi)多糖、胞外多糖含量可知，兩者均在以吐溫-20為溶劑的試驗(yàn)組最低，次低的是以無(wú)水乙醇為溶劑的試驗(yàn)組，而在以MeJA（吐溫-80）溶液為溶劑的試驗(yàn)組最高，較無(wú)水乙醇試驗(yàn)組分別提高了71%、34%。
2.4 Ca2+介導(dǎo)MeJA的影響（添加Ca2+對(duì)MeJA誘導(dǎo)作用的影響）
如圖3所示，發(fā)酵后牛樟芝生物量、胞外多糖含量和胞內(nèi)多糖含量均呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，表現(xiàn)為MeJA+CaCl2>MeJA>CaCl2>CK，而發(fā)酵后的三萜含量為MeJA+CaCl2>MeJA>CK>CaCl2。其中，效果最好的MeJA+CaCl2組牛樟芝的生物量、三萜含量、胞外多糖含量和胞內(nèi)多糖含量分別為 10.91 g/L、13.48 mg/g、6.36 g/L、8.80 mg/g，分別較CK提高了79.10%、27.90%、77.20%、103.02%。
3 結(jié)論與討論
茉莉酸甲酯對(duì)多種次生代謝產(chǎn)物的合成具有誘導(dǎo)作用[14]，近些年來(lái)也陸續(xù)出現(xiàn)將其用于微生物發(fā)酵上的研究。辛燕花等將MeJA添加于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)它能夠提高靈芝多糖、靈芝酸的產(chǎn)量[15]。楊文建等發(fā)明了1種用MeJA溶液噴灑雙孢蘑菇的方法，經(jīng)證實(shí)該方法能夠促進(jìn)雙孢蘑菇產(chǎn)麥角甾醇[16]。此外，MeJA還能夠促進(jìn)微生物細(xì)胞中萜類物質(zhì)的合成，Ren等首次將MeJA作為誘導(dǎo)劑添加到靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其靈芝三萜的產(chǎn)量比未經(jīng)處理的提高了45.3%[6]。向超也證實(shí)，用MeJA誘導(dǎo)樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)三萜，其三萜總產(chǎn)量較對(duì)照提高了53.2%[7]。本研究結(jié)果表明，在液體發(fā)酵過(guò)程中添加MeJA，能顯著提高牛樟芝發(fā)酵的生物量與三萜、胞外多糖、胞內(nèi)多糖含量，最適宜的添加濃度為50 μmol/L，于培養(yǎng)4d時(shí)對(duì)各指標(biāo)的促進(jìn)效果最佳，以吐溫-80作為溶劑最有利于MeJA發(fā)揮促進(jìn)作用。而有研究發(fā)現(xiàn)，吐溫-20對(duì)牛樟芝的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，這可能由于其具有較短的碳鏈，作為表面活性劑在細(xì)胞壁內(nèi)表現(xiàn)出較高的擴(kuò)散率，可能會(huì)造成細(xì)胞膜受損，或者影響與其他細(xì)胞內(nèi)生物分子的相互作用，甚至?xí)档图?xì)胞的存活率[17]。
目前，MeJA誘導(dǎo)微生物產(chǎn)三萜的機(jī)制已經(jīng)明確，這些萜類化合物都是由單個(gè)異戊二烯通過(guò)甲羥戊酸途徑合成得到的，MeJA能夠促使甲羥戊酸途徑中hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs、osc、lss和ss等相關(guān)酶基因的超表達(dá)[18-21]。以茯苓為研究對(duì)象，探究MeJA誘導(dǎo)其產(chǎn)三萜的效果及機(jī)制發(fā)現(xiàn)，于發(fā)酵第4天添加MeJA溶液（150 μmol/L），可使得到的三萜含量較空白組增加0.55倍;實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析可知，其sqs（甲基戊酸途徑鯊烯合酶基因）和fps（法尼基焦磷酸合成酶基因）的表達(dá)水平均發(fā)生了顯著上調(diào)[22]。任昂也以靈芝為材料，探究了在三萜的生物合成途徑中，關(guān)鍵酶編碼基因轉(zhuǎn)錄受MeJA的影響，結(jié)果表明，hmgr、fps、sqs、osc等基因均被誘導(dǎo)表達(dá)[23]。
鈣有多種生物學(xué)功能，是非常重要的第二信使，通過(guò)改變細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+濃度，可以將細(xì)胞表面上接收的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，并由一系列效應(yīng)器接收和分析，調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)、發(fā)育等生理反應(yīng)[24]，在微生物中，Ca2+經(jīng)常作為活性酶的輔因子或激活因子發(fā)揮作用[25]。在本研究中，同時(shí)添加MeJA、CaCl2時(shí)，牛樟芝發(fā)酵后的生物量、三萜含量、胞外多糖和胞內(nèi)多糖含量較單獨(dú)添加MeJA及其他試驗(yàn)組明顯提高。結(jié)果表明，Ca2+對(duì)MeJA誘導(dǎo)牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)三萜等有用物質(zhì)起到了積極的介導(dǎo)作用，這與王艷用Ca2+介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)白樺懸浮培養(yǎng)產(chǎn)三萜的試驗(yàn)結(jié)果相似[26]。
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張知曉 季梅 劉凌 戶連榮
摘要：為了探討茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)牛樟芝（Antrodia camphorata）發(fā)酵產(chǎn)三萜及多糖的影響及Ca2+對(duì)MeJA的誘導(dǎo)作用，向牛樟芝發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入MeJA溶液，設(shè)置不同添加濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）、不同時(shí)間（0、2、4、6、8 d）、不同溶劑3組試驗(yàn)，培養(yǎng)后檢測(cè)牛樟芝生物量、三萜、胞外多糖及胞內(nèi)多糖的含量，并同樣測(cè)試添加CaCl2的效果。結(jié)果表明，用MeJA處理牛樟芝，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)總?cè)?、多糖具有積極的促進(jìn)作用，并且于培養(yǎng)4 d時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加用吐溫-80溶解的50 μmol/L MeJA溶液，促進(jìn)作用最佳。此外，在添加MeJA的同時(shí)添加CaCl2的處理較僅添加MeJA的處理的牛樟芝生物量、三萜、胞外多糖及胞內(nèi)多糖含量顯著增加。
關(guān)鍵詞：牛樟芝;MeJA;Ca2+;總?cè)?多糖
中圖分類號(hào)： S646.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0133-04
收稿日期：2019-01-03
基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目青年項(xiàng)目（編號(hào)：2016FD096）。
作者簡(jiǎn)介：張知曉（1988—），女，云南個(gè)舊人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樯治⑸镔Y源的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：36062613@qq.com。
通信作者：戶連榮，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樯稚鷳B(tài)保護(hù)與研究。E-mail：444387051@qq.com。
牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、樟生薄孔菌等，是分屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌屬（Antrodia）的珍稀藥用真菌[1]，被譽(yù)為“森林中的紅寶石”[2]。牛樟芝中的三萜類物質(zhì)是其最主要的1種藥用化學(xué)成分，可以起到保肝護(hù)肝、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、降血壓、抗炎癥的作用，且牛樟芝中三萜類化合物的含量和種類都是靈芝的數(shù)倍，樟芝三萜也因此成為開(kāi)發(fā)樟芝的研究重點(diǎn)之一[3]。此外，樟芝中含有的多糖對(duì)人體起到提高免疫力、抑制病毒的作用，對(duì)保護(hù)肝臟也有一定的效果[4]。
茉莉酸甲酯（MeJA）是一種脂肪酸衍生物，在植物中起著信號(hào)傳遞的作用，同時(shí)能夠明顯促進(jìn)植物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物[5]。已有研究表明，將MeJA作為誘導(dǎo)劑添加到靈芝（Ganoderma lucidum）和樺褐孔菌（Inonotus obliquus）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后的三萜產(chǎn)量均較對(duì)照有明顯提高[6-7]。而在這方面，關(guān)于同屬多孔菌目牛樟芝的研究還未見(jiàn)報(bào)道。此外，鈣（Ca）是生物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與構(gòu)成生物組織，調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)發(fā)育，參與調(diào)控植物抗逆等生理反應(yīng)[8]。已有部分研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+參與MeJA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，如馬泓思等發(fā)現(xiàn)，外源Ca2+離子能進(jìn)一步增強(qiáng)MeJA 誘導(dǎo)的白樺（Betula platyphylla）細(xì)胞懸浮液合成三萜類物質(zhì)的效果[9]。而關(guān)于Ca2+促進(jìn)MeJA誘導(dǎo)真菌合成三萜類物質(zhì)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。基于牛樟芝中的三萜、多糖具有極高的藥用價(jià)值，本研究以牛樟芝為試驗(yàn)材料，研究MeJA對(duì)牛樟芝2種藥用成分的影響及Ca2+處理對(duì)MeJA作用的影響，以期初步探明1種增加牛樟芝三萜及多糖產(chǎn)量的方法。
1 材料與方法
1.1 供試材料
本研究所用菌種為從中國(guó)臺(tái)灣引進(jìn)的牛樟芝優(yōu)良菌株。
1.1.1 培養(yǎng)基和菌株培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：25 g葡萄糖，5 g蛋白胨，3 g麥芽糖，3 g酵母提取物，1 g KH2PO4，1 g MgSO4，1 g維生素B1，1 L水，pH值5.5。
孢子懸浮液的制備方法：取已培養(yǎng)20d的牛樟芝培養(yǎng)皿，用20 mL無(wú)菌水洗下培養(yǎng)皿表面的孢子備用。
基礎(chǔ)培養(yǎng)方法：在500 mL三角瓶中裝100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接入1 mL牛樟芝孢子懸浮液，搖床上于100 r/min、26 ℃恒溫培養(yǎng)12 d后，收集菌絲。
1.1.2 主要試劑 茉莉酸甲酯，購(gòu)于Sigma公司;齊墩果酸及其他試劑，購(gòu)于昆明騰科科技有限公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 本試驗(yàn)于2018年3—7月在云南省林業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
1.2.2 樣品處理 （1）將MeJA用無(wú)水乙醇配制成終濃度為25、50、75、100、200 μmol/L的溶液。采用0.2 μm的無(wú)菌針頭式過(guò)濾器過(guò)濾進(jìn)行滅菌處理后，在基礎(chǔ)搖瓶發(fā)酵方法的基礎(chǔ)上，于4 d后添加到培養(yǎng)基中，添加量為2 μL/mL，搖床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析其生物量、總?cè)屏俊麅?nèi)多糖和胞外多糖量。
（2）將MeJA用無(wú)水乙醇配制成終濃度為50 μmol/L的溶液。于不同培養(yǎng)時(shí)間（培養(yǎng)0、2、4、6、8d）添加到培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析。
（3）以無(wú)水乙醇、吐溫-20、吐溫-80作為助溶劑，將MeJA配制成終濃度為50 μmol/L的溶液，于4 d后添加到培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析，篩選出MeJA的最佳添加方案。
在MeJA最佳添加方案的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中同時(shí)添加CaCl2，使CaCl2的終濃度為75 nmol/L。另外設(shè)置2組對(duì)照組，分別僅向培養(yǎng)基中添加MeJA、CaCl2。設(shè)3組獨(dú)立試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣分析其生物量、總?cè)屏俊麅?nèi)多糖和胞外多糖量。
1.2.3 生物量的測(cè)定 生物量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]。通過(guò)抽濾分離發(fā)酵液與菌絲體，菌絲體用蒸餾水反復(fù)沖洗至洗液變?yōu)闊o(wú)色，置于干燥箱中，于70 ℃烘干至恒質(zhì)量，對(duì)干燥菌絲體用精度為0.001 g的電子天平稱量，即得菌絲體生物量。
1.2.4 菌絲體內(nèi)總?cè)坪康臏y(cè)定 采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色體系對(duì)總?cè)坪窟M(jìn)行測(cè)定。具體步驟參考楊彬君等的方法[11]。
1.2.5 胞外多糖含量的測(cè)定 胞外多糖含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[12]。將發(fā)酵液（用濾紙）過(guò)濾，取100 mL濾液在 60 ℃ 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使濾液濃縮至原體積的1/3，加3倍體積的無(wú)水乙醇靜置沉淀24 h，4 000 r/min離心分離15 min，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇輕輕沖洗后，用烘箱于50 ℃烘干至恒質(zhì)量，得到胞外粗多糖。
1.2.6 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13]。將菌絲體用烘箱烘干至恒質(zhì)量，研磨過(guò)篩，置于圓底燒瓶中，加30倍體積的水，于80 ℃水浴1 h，水浴提取后，再用超聲波提取30 min，重復(fù)2次提取多糖，合并提取液，離心、過(guò)濾，濾液用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和數(shù)理分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 MeJA不同添加濃度對(duì)牛樟芝發(fā)酵特性的影響
MeJA不同添加濃度對(duì)牛樟芝生物量及三萜含量的影響如圖1-a所示，可見(jiàn)當(dāng)MeJA添加濃度為25 μmol/L時(shí)，1L發(fā)酵液中的牛樟芝生物量達(dá)9.46 g;當(dāng)MeJA添加濃度為50 μmol/L 時(shí)，牛樟芝的生物量達(dá)9.25 g/L，與MeJA添加濃度為25 μmol/L處理間的生物量無(wú)顯著差異;當(dāng)MeJA添加濃度為0 μmol/L時(shí)，牛樟芝的生物量較MeJA添加濃度為 25 μmol/L 時(shí)降低了2.55 g/L，但顯著高于MeJA添加濃度為100、200 μmol/L時(shí)的生物量。三萜含量在MeJA添加濃度為50 μmol/L時(shí)最高（14.21 mg/g），其次為MeJA添加濃度為25、100 μmol/L的處理，當(dāng)MeJA添加濃度為0、200 μmol/L時(shí)，三萜含量最低。
MeJA不同添加濃度對(duì)牛樟芝胞外多糖及胞內(nèi)多糖含量的影響如圖1-b所示，可見(jiàn)當(dāng)MeJA添加濃度為50 μmol/L時(shí)，牛樟芝胞外多糖、胞內(nèi)多糖含量均最高，分別為 10.27 g/L、11.5mg/g;當(dāng)MeJA添加濃度為0、200 μmol/L時(shí)，胞外多糖含量均較低，二者間無(wú)顯著差異，而當(dāng)胞內(nèi)多糖含量最低時(shí)，對(duì)應(yīng)的MeJA添加濃度為200 μmol/L。
2.2 MeJA不同添加時(shí)間對(duì)牛樟芝發(fā)酵特性的影響
MeJA不同添加時(shí)間對(duì)牛樟芝生物量及三萜含量的影響如圖2-a所示，可以看出，于培養(yǎng)4 d時(shí)添加MeJA發(fā)酵的牛樟芝生物量顯著高于其他時(shí)間的生物量，為12.04 g/L，而于培養(yǎng)8 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的生物量最低，僅為7.11 g/L。于培養(yǎng)0、2、4 d時(shí)添加MeJA的三萜含量分別為15.48、15.12、16.42 mg/g，三者間無(wú)顯著差異，但顯著高于其他試驗(yàn)組。
MeJA不同添加時(shí)間對(duì)牛樟芝胞外多糖及胞內(nèi)多糖含量的影響如圖2-b所示，可以看出，于培養(yǎng)4 d時(shí)添加MeJA發(fā)酵的胞外多糖含量最高，達(dá)15.18 g/L，于培養(yǎng)6、8 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的胞外多糖含量較低，分別較培養(yǎng)4 d時(shí)降低了53%、60%。同樣，于培養(yǎng)4 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的胞內(nèi)多糖含量最高（12.2 mg/g），其次是培養(yǎng)2 d時(shí)添加MeJA的胞內(nèi)多糖含量，二者間無(wú)顯著差異， 于培養(yǎng)8 d時(shí)添加MeJA產(chǎn)生的胞內(nèi)多糖含量最低，僅為6.4 mg/g。
2.3 MeJA不同溶劑對(duì)牛樟芝發(fā)酵特性的影響
由表1可以看出，以吐溫-80為溶劑的MeJA溶液對(duì)牛樟芝發(fā)酵后生物量的促進(jìn)作用最佳，生物量達(dá)到8.25 g/L，單獨(dú)添加吐溫-80溶液的效果次之;以無(wú)水乙醇為溶劑的MeJA溶液處理的生物量為6.16 g/L，單獨(dú)添加無(wú)水乙醇溶液的生物量為3.48 g/L;以吐溫-20為溶劑的MeJA溶液和單獨(dú)添加吐溫-20的溶液發(fā)酵的牛樟芝生物量均為0 g/L。幾組處理的三萜含量排序如下：添加MeJA（無(wú)水乙醇）溶液≥添加MeJA（吐溫-80）溶液>吐溫-80≥無(wú)水乙醇。
比較胞內(nèi)多糖、胞外多糖含量可知，兩者均在以吐溫-20為溶劑的試驗(yàn)組最低，次低的是以無(wú)水乙醇為溶劑的試驗(yàn)組，而在以MeJA（吐溫-80）溶液為溶劑的試驗(yàn)組最高，較無(wú)水乙醇試驗(yàn)組分別提高了71%、34%。
2.4 Ca2+介導(dǎo)MeJA的影響（添加Ca2+對(duì)MeJA誘導(dǎo)作用的影響）
如圖3所示，發(fā)酵后牛樟芝生物量、胞外多糖含量和胞內(nèi)多糖含量均呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，表現(xiàn)為MeJA+CaCl2>MeJA>CaCl2>CK，而發(fā)酵后的三萜含量為MeJA+CaCl2>MeJA>CK>CaCl2。其中，效果最好的MeJA+CaCl2組牛樟芝的生物量、三萜含量、胞外多糖含量和胞內(nèi)多糖含量分別為 10.91 g/L、13.48 mg/g、6.36 g/L、8.80 mg/g，分別較CK提高了79.10%、27.90%、77.20%、103.02%。
3 結(jié)論與討論
茉莉酸甲酯對(duì)多種次生代謝產(chǎn)物的合成具有誘導(dǎo)作用[14]，近些年來(lái)也陸續(xù)出現(xiàn)將其用于微生物發(fā)酵上的研究。辛燕花等將MeJA添加于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)它能夠提高靈芝多糖、靈芝酸的產(chǎn)量[15]。楊文建等發(fā)明了1種用MeJA溶液噴灑雙孢蘑菇的方法，經(jīng)證實(shí)該方法能夠促進(jìn)雙孢蘑菇產(chǎn)麥角甾醇[16]。此外，MeJA還能夠促進(jìn)微生物細(xì)胞中萜類物質(zhì)的合成，Ren等首次將MeJA作為誘導(dǎo)劑添加到靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其靈芝三萜的產(chǎn)量比未經(jīng)處理的提高了45.3%[6]。向超也證實(shí)，用MeJA誘導(dǎo)樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)三萜，其三萜總產(chǎn)量較對(duì)照提高了53.2%[7]。本研究結(jié)果表明，在液體發(fā)酵過(guò)程中添加MeJA，能顯著提高牛樟芝發(fā)酵的生物量與三萜、胞外多糖、胞內(nèi)多糖含量，最適宜的添加濃度為50 μmol/L，于培養(yǎng)4d時(shí)對(duì)各指標(biāo)的促進(jìn)效果最佳，以吐溫-80作為溶劑最有利于MeJA發(fā)揮促進(jìn)作用。而有研究發(fā)現(xiàn)，吐溫-20對(duì)牛樟芝的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，這可能由于其具有較短的碳鏈，作為表面活性劑在細(xì)胞壁內(nèi)表現(xiàn)出較高的擴(kuò)散率，可能會(huì)造成細(xì)胞膜受損，或者影響與其他細(xì)胞內(nèi)生物分子的相互作用，甚至?xí)档图?xì)胞的存活率[17]。
目前，MeJA誘導(dǎo)微生物產(chǎn)三萜的機(jī)制已經(jīng)明確，這些萜類化合物都是由單個(gè)異戊二烯通過(guò)甲羥戊酸途徑合成得到的，MeJA能夠促使甲羥戊酸途徑中hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs、osc、lss和ss等相關(guān)酶基因的超表達(dá)[18-21]。以茯苓為研究對(duì)象，探究MeJA誘導(dǎo)其產(chǎn)三萜的效果及機(jī)制發(fā)現(xiàn)，于發(fā)酵第4天添加MeJA溶液（150 μmol/L），可使得到的三萜含量較空白組增加0.55倍;實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析可知，其sqs（甲基戊酸途徑鯊烯合酶基因）和fps（法尼基焦磷酸合成酶基因）的表達(dá)水平均發(fā)生了顯著上調(diào)[22]。任昂也以靈芝為材料，探究了在三萜的生物合成途徑中，關(guān)鍵酶編碼基因轉(zhuǎn)錄受MeJA的影響，結(jié)果表明，hmgr、fps、sqs、osc等基因均被誘導(dǎo)表達(dá)[23]。
鈣有多種生物學(xué)功能，是非常重要的第二信使，通過(guò)改變細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+濃度，可以將細(xì)胞表面上接收的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，并由一系列效應(yīng)器接收和分析，調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)、發(fā)育等生理反應(yīng)[24]，在微生物中，Ca2+經(jīng)常作為活性酶的輔因子或激活因子發(fā)揮作用[25]。在本研究中，同時(shí)添加MeJA、CaCl2時(shí)，牛樟芝發(fā)酵后的生物量、三萜含量、胞外多糖和胞內(nèi)多糖含量較單獨(dú)添加MeJA及其他試驗(yàn)組明顯提高。結(jié)果表明，Ca2+對(duì)MeJA誘導(dǎo)牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)三萜等有用物質(zhì)起到了積極的介導(dǎo)作用，這與王艷用Ca2+介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)白樺懸浮培養(yǎng)產(chǎn)三萜的試驗(yàn)結(jié)果相似[26]。
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