吳 婧,唐曉婷,黃阿妹,房太勇

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科,福建 泉州 362000)

谷氨酰胺連接酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)又稱谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是在大多數(shù)物種中發(fā)現(xiàn)的一種ATP依賴性酶，能將谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，用于保持谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)以及氮代謝。GLUL是以ATP依賴性反應(yīng)催化從谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。該蛋白質(zhì)在氨和谷氨酸解毒、酸-堿穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖中起作用。GLUL的表達(dá)與肝、腸上皮、視網(wǎng)膜和乳腺等細(xì)胞增殖相關(guān)。GLUL在肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌中上調(diào)，可能是一種新的診斷標(biāo)志物。但該基因在結(jié)腸癌中的生物學(xué)作用目前尚未報(bào)道，尤其與Akt及ERK增殖及侵襲相關(guān)信號(hào)通路作用不明確。因此，本研究擬探索GLUL如何通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/ERK信號(hào)途徑來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

1 對(duì)象及方法

1.1對(duì)象 結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，在37 ℃和5 %的CO2培養(yǎng)條件下含，培養(yǎng)于10 %的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中每隔2～3 d傳代1次；設(shè)計(jì)針對(duì)GLUL基因的靶向干擾質(zhì)粒，真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-1購(gòu)于上海禾午生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GLUL基因轉(zhuǎn)錄水平 分別收獲對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SW480細(xì)胞、SW480-siGLUL細(xì)胞，取5×107個(gè)細(xì)胞加入1.5 mL離心管中，用槍頭吹吸含有1 mL的Trizol液至混勻，室溫放置5 min；每管中再加入0.2 mL氯仿，充分顛倒混勻，12 000 g轉(zhuǎn)速4 ℃ 離心5 min；每管再加入1 μL的RNase H，37 ℃反應(yīng)20 min。GLUL基因引物上游序列5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3',下游序列5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'；β-actin引物上游序列5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游序列5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.2.2Western Blot檢測(cè)GLUL基因翻譯水平 分別收獲對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SW480細(xì)胞、SW480-siGLUL細(xì)胞，100 μL細(xì)胞裂解液加入106個(gè)細(xì)胞溶液，裂解20 min；12 000 g于4 ℃離心5 min；將上清移至離心管中，-70 ℃保存；蛋白濃度用Bradford法檢測(cè)，每組細(xì)胞取30 μg蛋白加入緩沖液混勻，沸水處理5 min，加入蛋白電泳槽；分別加入抗人GLUL單克隆抗體、抗鼠β-actin單克隆抗體，搖動(dòng)孵育過(guò)夜，將抗體抗原充分融合，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗稀釋于5 %脫脂牛奶中，緩慢搖動(dòng)室溫孵育2 h，PBS漂洗10 min，共3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，觀測(cè)結(jié)果。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將對(duì)照組SW480-Pu6和實(shí)驗(yàn)組siGLUL-SW480細(xì)胞擴(kuò)增充分后消化處理，接種于96孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種后培養(yǎng)24 h，48 h，72 h行MTT檢測(cè)，將5 mg/mL的MTT試劑以每孔20 μL加入待測(cè)96孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)4 h，注射器緩慢吸取上清液，并棄用，每孔加200 μL的DMSO搖床充分振蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將對(duì)照組SW480-Pu6和實(shí)驗(yàn)組siGLUL-SW480細(xì)胞分別接種于六孔板中，等其細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至95 %時(shí)，用同一槍頭分別劃痕，于劃痕后的0～24 h在顯微鏡下動(dòng)態(tài)拍照，比較兩組細(xì)胞的遷移數(shù)量。

1.2.5裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn) 將4～6個(gè)月大小相近的雄性裸鼠16只隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組將siGLUL穩(wěn)轉(zhuǎn)SW480細(xì)胞注射裸鼠皮下；對(duì)照組用同樣方法將轉(zhuǎn)染空載體的SW480細(xì)胞注射裸鼠皮下。飼養(yǎng)裸鼠至瘤體肉眼可觀測(cè)到。用游標(biāo)卡尺每隔4 d測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑、短徑，瘤體體積=[length(mm)×width(mm)2]/2，比較兩組裸鼠瘤體的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1GLUL在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中干擾效率 利用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)構(gòu)建穩(wěn)定GLUL的SW480細(xì)胞系干擾效率，結(jié)果顯示SW480-siGLUL細(xì)胞株1/2均有明顯干擾效果，其中siGLUL-1干擾效率最優(yōu)，以SW480-siGLUL-1細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究，如圖1。

圖1 GLUL基因沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在RNA和蛋白水平的驗(yàn)證

2.2GLUL基因沉默抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移功能 利用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組SW480-siGLUL細(xì)胞和對(duì)照組SW480-Pu6細(xì)胞增長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示24 h，48 h，72 h，與對(duì)照組比較，siGLUL轉(zhuǎn)染SW480實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖明顯減少(t24h=9.238,t48h=11.379,t72h=8.213，P<0.05)，如圖1-A；細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組siGLUL轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞遷移數(shù)量較對(duì)照組減低(t=7.921;P<0.05)，如圖1-B。

2.3SGLUL抑制AKT及ERK介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)途徑 Western Blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組SW480-siGLUL細(xì)胞AKT的磷酸化水平明顯下降，如圖2，活性減弱；ERK1/2的磷酸化水平明顯下降，活性增強(qiáng)(ERK1/2的活性形式為去磷酸化)，如圖2。

圖2 GLUL基因表達(dá)沉默對(duì)AKT-和ERK-細(xì)胞信號(hào)通路的影響

2.4GLUL基因沉默抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng) 實(shí)驗(yàn)組SW480-siGLUL細(xì)胞及對(duì)照組SW480-Pu6細(xì)胞分別注射裸鼠皮下，誘導(dǎo)裸鼠皮下移植瘤產(chǎn)生(圖2-A)；與對(duì)照組相比，4 d、7 d、10 d、13 d及16 d實(shí)驗(yàn)組移植siGLUL-SW480細(xì)胞裸鼠瘤體體積明顯減小(P<0.01)，如圖2-B。

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)消化道腫瘤之一，但多數(shù)患者診斷時(shí)已屬晚期，且化療中易出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致結(jié)腸癌預(yù)后較差。因此，闡明結(jié)腸癌演進(jìn)生物學(xué)機(jī)制并尋找有效診治靶點(diǎn)迫在眉睫。谷氨酰胺在腫瘤生長(zhǎng)中扮演重要角色。但是，與葡萄糖代謝在腫瘤中的意義相比，谷氨酰胺代謝在腫瘤中的作用了解甚少。因此，本研究探討谷氨酰胺合成代謝關(guān)鍵酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。本研究觀察GLUL基因表達(dá)沉默后對(duì)SW480細(xì)胞功能的影響，MTT及細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示干擾GLUL可抑制細(xì)胞增殖和遷移，證實(shí)GLUL對(duì)SW480細(xì)胞增殖和遷移具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示GLUL對(duì)腫瘤形成的重要作用，與對(duì)照組相比，GLUL干擾后裸鼠皮下瘤的生長(zhǎng)速度和瘤體大小均減少。由此可見(jiàn)，GLUL在結(jié)腸癌發(fā)展中扮演重要角色。關(guān)于GLUL介導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)展的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

在諸多信號(hào)傳導(dǎo)途徑中AKT及ERK通路處于核心地位，在胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能。AKT及ERK信號(hào)通路可以激活下游信號(hào)分子，也可與其它信號(hào)分子相互影響并引起級(jí)聯(lián)活化效應(yīng)。因此，AKT及ERK信號(hào)在諸多信號(hào)傳導(dǎo)途徑中處于核心地位。那么，在結(jié)腸癌中GLUL是否也是介導(dǎo)AKT及ERK信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖及侵襲等生物學(xué)表型目前仍不清楚。本研究顯示GLUL基因沉默的SW480細(xì)胞，p-AKT和p-ERK的表達(dá)也隨之下調(diào)，即AKT、ERK的活性均下降，因此初步認(rèn)為GLUL也是通過(guò)AKT/ERK途徑來(lái)影響結(jié)腸癌生長(zhǎng)。

綜上所述，GLUL促進(jìn)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和遷移，從而促進(jìn)人類結(jié)腸癌的發(fā)展過(guò)程，這一過(guò)程是通過(guò)影響Akt和ERK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。GLUL是谷氨酰胺合成的關(guān)鍵酶，后者是腫瘤細(xì)胞除Warburg效應(yīng)外獲取能量來(lái)源的重要途徑，也是細(xì)胞內(nèi)氮源重要的供體。GLUL有望成為結(jié)腸癌基因治療生物靶點(diǎn)。