張媛，納濤，吳彥霖，楊澤岸，高華

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

骨肽是從新鮮或冷凍的豬、鹿等哺乳動(dòng)物骨中提取，加工制成的具有活性的多組分生化藥［1-2］，內(nèi)含骨形成蛋白等多種骨代謝活性因子，以及骨修復(fù)所需的無機(jī)元素、微量元素等［3-4］。骨肽具有調(diào)節(jié)骨代謝、刺激成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)新骨形成等藥理作用［5-6］。骨肽類藥物相關(guān)品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要收載于國家標(biāo)準(zhǔn)地升部十六冊(cè)，未包含生物活性測定項(xiàng)目，僅采用雙縮脲法或福林酚法檢測含量［7-8］，而這兩種方法對(duì)動(dòng)植物中含有肽鍵的多肽均可產(chǎn)生反應(yīng)，專屬性差。為了進(jìn)一步完善骨肽藥物的質(zhì)量可控性，使現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)更全面、合理，本實(shí)驗(yàn)室建立了骨肽生物活性測定的UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)［9］。該方法可簡便、高效、穩(wěn)定地測定骨肽類藥物的生物活性。但由于UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)使用的培養(yǎng)基為不含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基［9］，而谷氨酰胺是培養(yǎng)細(xì)胞的重要能量來源，參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及核酸代謝。因此，本研究針對(duì)谷氨酰胺是否影響UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)進(jìn)行探討，以期對(duì)本方法進(jìn)行完善。

1 材料與方法

1.1 骨肽及細(xì)胞13個(gè)生產(chǎn)廠家（廠家A～M）的骨肽原液各1批，骨肽含量分別為60、62、68.6、26.7、87.4、31.0、90.0、14.0、25.8、19.1、21.4、49.3、7.4 mg／mL；大鼠骨肉瘤細(xì)胞株（UMR106）購自美國ATCC（American TypeCulture Collection）。

1.2 主要試劑及儀器CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；谷氨酰胺、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購自美國GIBCO公司；磷酸鹽緩沖液購自美國Hyclone公司；乙腈（質(zhì)譜級(jí)）購自美國Fisher Chemical公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)）購自美國Sigma-Aldrich公司；Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色譜儀購自日本島津（SHIMADZU）；WATERS ACQUITY UPLC Column色譜柱，型號(hào)：ACQ-UITY UPLC BEH HILIC Column（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）購自美國WATERS公司；Triple TOF 5600+型質(zhì)譜儀購自美國AB SCIEX公司；Z2型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自美國Beckman Coulter；SYNERGY HT型酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.3 超高效液相色譜條件 色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC Column，型號(hào)：ACQUITY UPLC BEH HILIC Column（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫35℃；流動(dòng)相：A為100%乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。采用梯度洗脫，洗脫程序見表1［10-12］。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序（%）Tab.1 Elution program in ultra performance liquid chromatography（%）

1.4 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜掃描采用positive模式。ESI源條件如下：離子源氣流1（ion source gas 1）：50；離子源氣流2（ion source gas 2）：50；氣簾氣（curtain gas）：25；溫度（source tempreture）：500℃；電壓（ion sapary voltage floating）：5 500 V（正離子）；一級(jí)掃描范圍（TOF MS scan range）：50～200 Da；二級(jí)掃描范圍（product ion scan range）：50～200 Da；二級(jí)質(zhì)譜采用IDA（information dependent acquisition）獲得，并采用high sensitivity模式；去簇電壓（declustering potential）：±60 V；碎裂能量（collision energy）：（35±15）eV［10-12］。

1.5 骨肽原液中谷氨酰胺含量的檢測 以不同濃度的谷氨酰胺（13.1、26.2、65.5、105.0、131.0 ng／mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用液質(zhì)聯(lián)用，按照1.3和1.4項(xiàng)條件，檢測骨肽原液中谷氨酰胺含量。

1.6 谷氨酰胺對(duì)UMR106細(xì)胞增殖影響的檢測采用UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的UMR106細(xì)胞，0.25% Trypsin消化后，用含2.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，濃度為5×104cells／mL。每孔加入100 μL，即5 000 cells／孔，置37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h；棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含不同濃度（3.9、7.8、15.6、31.2、62.4、125、250、500、1 000、2 000、4 000和8 000 μmol／L）谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，陰性對(duì)照為不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，均100 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；CCK-8法進(jìn)行檢測［9，13］。

1.7 骨肽原液生物活性檢測 采用UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)，方法同1.6項(xiàng)。細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24 h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含1.0 mg／mL骨肽原液的的DMEM培養(yǎng)基，100 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；CCK-8法進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 骨肽原液中谷氨酰胺含量 獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1 948.83 x－7 658.22，r=0.996 38，見圖1。13個(gè)生產(chǎn)廠家骨肽原液中谷氨酰胺含量差距較大，B廠家含量最低，為2.17 μmol／L，L廠家最高，為135.48 μmol／L。見表2。其中13個(gè)廠家骨肽原液中谷氨酰胺試驗(yàn)應(yīng)用濃度為骨肽原液濃度1 mg／mL所對(duì)應(yīng)的谷氨酰胺濃度，即骨肽原液中谷氨酰胺濃度／骨肽原液濃度。

表2 13個(gè)生產(chǎn)廠家骨肽原液中谷氨酰胺含量Tab.3 Glutamine contents of bulks of osteopeptide from 13 manufacturers

圖1 谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of glutamine by LCMS

2.2 骨肽原液濃度與相應(yīng)谷氨酰胺濃度的相關(guān)性 結(jié)果顯示，二者間無顯著相關(guān)性（r=0.146 3，P＞0.05）。見圖2。

圖2 骨肽原液濃度及其相應(yīng)谷氨酰胺濃度的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation between osteopeptide concentration and the corresponding glutamine concentration

2.3 谷氨酰胺對(duì)UMR106細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示，UMR106細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺較為敏感，3.9、7.8、15.6、31.2、62.4、125、250、500、1 000、2 000、4 000和8 000 μmol／L谷氨酰胺對(duì)UMR106細(xì)胞的增殖率分別為105%、10%、113%、126%、152%、198%、225%、283%、336%、433%、445%和455%，即至谷氨酰胺濃度降至約4 μmol／L時(shí)，才未顯示出明顯的促增殖作用。而13個(gè)生產(chǎn)廠家的骨肽原液中谷氨酰胺試驗(yàn)應(yīng)用濃度，即折合成骨肽原液濃度1 mg／mL所對(duì)應(yīng)的谷氨酰胺濃度，均低于4 μmol／L，其中以L廠家最高，濃度為2.75 μmol／L。

2.4 骨肽原液生物活性 結(jié)果顯示，不同廠家骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖率具有明顯差異。13個(gè)廠家骨肽原液中谷氨酰胺試驗(yàn)應(yīng)用濃度與相應(yīng)細(xì)胞增殖率無顯著相關(guān)性（r=0.547 1，P＞0.05）。見圖3。

圖3 骨肽原液谷氨酰胺試驗(yàn)應(yīng)用濃度與相應(yīng)細(xì)胞增殖率相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between working concentration of glutamine in bulk of osteopeptide and the corresponding cell proliferation rate

3 討論

UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)作為骨肽類藥物生物活性測定的方法，可真實(shí)反應(yīng)骨肽類藥物的生物活性［14-15］。但該方法使用不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，而谷氨酰胺是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的一種必需氨基酸［16-17］，可作為細(xì)胞生長的主要能源和氮源，并參與合成嘌呤、嘧啶、蛋白質(zhì)和多肽［18-20］。因此，有必要考察谷氨酰胺對(duì)UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)的影響。本研究結(jié)果表明，13個(gè)生產(chǎn)廠家的骨肽原液中均含有不同濃度的谷氨酰胺，且差異較大，但與骨肽濃度無顯著相關(guān)性。而UMR106細(xì)胞增殖對(duì)谷氨酰胺較為敏感，谷氨酰胺濃度降低至約4 μmol／L時(shí)，對(duì)UMR106細(xì)胞才未顯示出明顯的促增殖作用。13個(gè)生產(chǎn)廠家的骨肽原液中谷氨酰胺試驗(yàn)應(yīng)用濃度，即折合成骨肽原液濃度1 mg／mL所對(duì)應(yīng)的谷氨酰胺濃度，均低于4 μmol／L，最高濃度僅為2.75 μmol／L，且與相應(yīng)的細(xì)胞增殖結(jié)果無顯著相關(guān)性。綜上所述，骨肽原液中自帶的谷氨酰胺并不會(huì)對(duì)骨肽生物活性測定方法——UMR106細(xì)胞增殖試驗(yàn)產(chǎn)生影響。但鑒于谷氨酰胺對(duì)UMR106細(xì)胞增殖影響較為明顯，建議在使用該方法測定骨肽生物活性時(shí)，同時(shí)測定骨肽樣品中谷氨酰胺的含量，要求1 mg／mL骨肽樣品中所對(duì)應(yīng)的谷氨酰胺濃度不高于4 μmol／L，從而防止相關(guān)骨肽樣品中添加過高含量的谷氨酰胺影響測定結(jié)果。