陳磊，孟慶敏，張改梅，孫光衛(wèi)，耿麗娜，金加洪，趙麗麗，謝學(xué)超，徐穎之，顧美榮，卞蓮蓮，劉建凱

1.北京民海生物科技有限公司研發(fā)中心 北京市新型聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，北京 102600；2.江蘇省連云港市贛榆區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 連云港 210000；3.江蘇省新沂市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 新沂 221400；4.江蘇省鹽城市射陽縣疾病預(yù)防控制中心，江蘇 鹽城 224300；5.中國(guó)食品藥品檢定研究院肝炎病毒疫苗室，北京 102600

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一種丙類傳染性疾病，常見于5歲以下嬰幼兒，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱及手、足、口腔等部位出現(xiàn)斑丘疹、皰疹［1］，部分病例可并發(fā)腦膜炎、心肌炎和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等重癥，甚至死亡［2］。HFMD的主要病原體為腸道病毒71型（enterovirus，EV71）、柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16，CA16）和柯薩奇病毒A組6型（coxsackievirus A6，CA6）等［3］，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。近年，CA6在全球范圍內(nèi)流行，在我國(guó)大陸及其他國(guó)家部分地區(qū)，CA6甚至取代EV71和CA16成為HFMD病原譜中占比最高的病原體［4-12］。CA6感染兒童引起的HFMD表現(xiàn)出一系列非典型癥狀或后遺癥，如非典型部位的皮疹皰疹、皮膚損傷、脫甲癥等［13］，且可導(dǎo)致成年人罹患HFMD，甚至可能導(dǎo)致長(zhǎng)期后遺癥［14-16］，給公共衛(wèi)生安全帶來較大負(fù)擔(dān)，加強(qiáng)對(duì)其防控具有重要意義。

目前，HFMD尚無有效預(yù)防措施和治療方法，接種疫苗是控制HFMD流行的重要手段。中和抗體效價(jià)是評(píng)價(jià)疫苗免疫原性的關(guān)鍵指標(biāo)之一［17-20］，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)疫苗研發(fā)和應(yīng)用均具有重要意義。本研究對(duì)北京民海生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱北京民海）研發(fā)中心從人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD細(xì)胞）自行分離獲得的CA6毒株作為中和抗體候選檢測(cè)毒株進(jìn)行病毒滴度標(biāo)定，并評(píng)價(jià)該毒株的專屬性和適用性，以期用于后續(xù)疫苗的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 毒株及細(xì)胞CA6候選檢測(cè)毒株由北京民海研發(fā)中心采自中國(guó)大陸HFMD流行區(qū)患兒的咽肛拭子，樣本經(jīng)RD細(xì)胞分離、蝕斑純化、適應(yīng)性傳代培養(yǎng)后，分裝（0.5 mL／支，500支），建立工作種子批，－60℃以下保存；RD細(xì)胞由該中心保存。

1.2 主要試劑MEM培養(yǎng)基購(gòu)自日本日水制藥株式會(huì)社；胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.3 血清CA6、EV71、CA16、CA10病毒收獲液免疫NIH小鼠獲得的血清（分別標(biāo)記為A6-S1、71-S1、A16-S1、A10-S1）及其陰性對(duì)照血清（病毒維持液免疫NIH小鼠獲得的血清，標(biāo)記為Z）由北京民海研發(fā)中心研發(fā)一室提供；人血清為江蘇和廣東地區(qū)的EV71和CA16等血清流行病學(xué)調(diào)查及EV71疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)前HFMD病例監(jiān)測(cè)的自然感染人血清。

1.4 CA6候選檢測(cè)毒株的檢測(cè) 根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020版）“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制”的要求，對(duì)工作種子批進(jìn)行鑒別試驗(yàn)、無菌檢查、支原體檢查、分子生物學(xué)鑒定等［21］。

1.5 CA6候選檢測(cè)毒株病毒滴度的測(cè)定 將1.5×105個(gè)／mL的RD細(xì)胞接種至96孔板中，0.1 mL／孔；接種CA6候選檢測(cè)毒株病毒液（10－3～10－10稀釋），100 μL／孔，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)8孔細(xì)胞對(duì)照（僅補(bǔ)加病毒維持液），于（35±0.5）℃，5%CO2培養(yǎng)箱中放置7 d，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）情況。以能使50%細(xì)胞孔發(fā)生CPE的最高稀釋度為終點(diǎn)，1個(gè)視野下出現(xiàn)CPE即判為陽性（+），否則判為陰性（－），并按下式計(jì)算病毒滴度［22］。由3名實(shí)驗(yàn)員（A、B、C）于3 d分別進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)定，根據(jù)27次檢測(cè)結(jié)果標(biāo)定該毒株的病毒滴度。

式中L為病毒最低稀釋度的對(duì)數(shù)值，d為稀釋度系數(shù)對(duì)數(shù)值，S為CPE陽性孔比率總和。

1.6 中和抗體檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［23-24］方法，建立CA6中和抗體檢測(cè)方法。待測(cè)樣品（1∶8稀釋）經(jīng)56℃滅活30 min；加至96孔板中，0.05 mL／孔，進(jìn)行2倍系列稀釋（1∶8～1∶16 384），加入100 CCID50／50 μL的CA6病毒懸液，50 μL／孔，于37℃中和2 h；加入1.5×105個(gè) ／mL的RD細(xì)胞懸液，0.1 mL／孔，置（35±0.5）℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。每次試驗(yàn)均設(shè)病毒回滴試驗(yàn)，結(jié)果在32～320 CCID50／孔判為試驗(yàn)成立。以能抑制50%細(xì)胞病變最高稀釋度的倒數(shù)作為CA6抗體中和效價(jià)，≥1∶8判為CA6中和抗體陽性，＜1∶8判為陰性。

1.7 CA6候選檢測(cè)毒株的專屬性評(píng)價(jià) 將血清A6-S1、71-S1、A16-S1、A10-S1和Z用CA6候選檢測(cè)毒株分別進(jìn)行中和抗體效價(jià)測(cè)定，方法同1.6項(xiàng)，每份血清重復(fù)測(cè)定2次。

1.8 CA6候選檢測(cè)毒株的適用性評(píng)價(jià) 分別取12份CA6小鼠免疫血清（編號(hào)為M1～M12）和12份CA6自然感染人血清（P1～P12），用CA6候選檢測(cè)毒株進(jìn)行中和抗體測(cè)定，方法同1.6項(xiàng)，每份血清重復(fù)測(cè)定6次，并計(jì)算中和抗體效價(jià)的幾何平均值（geometric mean titer，GMT）。CA6抗體中和效價(jià)為陰性時(shí)，按1∶4計(jì)算，CA6抗體中和效價(jià)＞1∶16 384時(shí)，按1∶24 576計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0和EXCEL 2020進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同實(shí)驗(yàn)員對(duì)CA6候選檢測(cè)毒株病毒滴度檢測(cè)結(jié)果的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA6候選檢測(cè)毒株工作種子批檢測(cè)結(jié)果CA6候選檢測(cè)毒株工作種子批無菌檢查、支原體檢查均符合要求；分子生物學(xué)鑒定屬D3亞型；CA6候選檢測(cè)毒株感染RD細(xì)胞3 d后發(fā)生明顯CPE，見圖1。

圖1 CA6候選檢測(cè)毒株致RD細(xì)胞CPE的鏡下觀察（×100）Fig.1 Microscopy of CPE of RD cells infected with candidate CA6 strain（×100）

2.2 CA6候選檢測(cè)毒株的病毒滴度A、B、C實(shí)驗(yàn)員測(cè)定病毒滴度均值分別為（7.861±0.075）、（7.819±0.110）、（7.875±0.140）LgCCID50／mL，95% CI分別為（7.803～7.919）、（7.735～7.904）、（7.768～7.875）LgCCID50／mL，CV分別為0.96%、1.41%、1.77%，3名實(shí)驗(yàn)員的檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.605，P＞0.05），見表1。最終標(biāo)定該毒株病毒滴度為7.852 LgCCID50／mL（95% CI：7.808～7.895 LgCCID50／mL）。

表1 病毒滴度檢測(cè)結(jié)果（LgCCID50／mL）Tab.1 Determination result of virus titer（LgCCID50／mL）

2.3 CA6候選檢測(cè)毒株的專屬性 重復(fù)2次測(cè)定A6-S1的中和抗體效價(jià)分別為1∶3 072和1∶4 096，為陽性；71-S1、A16-S1、A10-S1和Z的中和抗體效價(jià)均＜1∶8，為陰性。表明CA6候選檢測(cè)毒株具有良好的專屬性。

2.4 CA6候選檢測(cè)毒株的適用性12份小鼠血清中和抗體GMT為1∶82～1∶22 970，12份自然感染人血清中和抗體GMT為1∶41～1∶22 970。每份血清重復(fù)檢測(cè)中和抗體效價(jià)的最大值與最小值（MAX／MIN）比值均 ＜4，CV在1.65%～12.44%之間。見表2，表明CA6候選檢測(cè)毒株具有良好的適用性。

表2 CA6候選檢測(cè)毒株適用性評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Evaluation of applicability of candidate CA6 strain

3 討論

HFMD是一種常見傳染病，目前已成為亞太地區(qū)尤其是中國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。全球范圍內(nèi)，該病的流行病原在不斷變化，自2008年以來，CA6型HFMD在芬蘭暴發(fā)［25］，隨后該型HFMD在多個(gè)國(guó)家及地區(qū)迅速流行［26-29］。近年，根據(jù)獲得的HFMD流行病學(xué)和病原學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，認(rèn)為CA6與EV71和CA16一樣，可通過接種疫苗進(jìn)行預(yù)防［30］。目前，EV71疫苗已上市，CA16單價(jià)疫苗及重組EV71／CA16雙價(jià)疫苗處于臨床前試驗(yàn)階段［31-32］，其對(duì)CA6均無交叉保護(hù)，因此急需進(jìn)行CA6疫苗或多價(jià)疫苗的研制。

在CA6單價(jià)疫苗或多價(jià)疫苗的研制過程中，CA6中和抗體效價(jià)檢測(cè)是疫苗研制中的重要檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)方法的建立至關(guān)重要。CA6候選檢測(cè)毒株由北京民海研發(fā)中心采用RD細(xì)胞自行分離，建立了工作種子批，本研究對(duì)工作種子批進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，結(jié)果顯示，工作種子批無菌檢查、支原體檢查均符合要求，分子生物學(xué)鑒定屬D3亞型。該毒株與同為腸道病毒屬的EV71、CA16、CA10免疫血清均無交叉，僅被CA6免疫血清中和，具有良好的專屬性。由3名實(shí)驗(yàn)員對(duì)工作種子批進(jìn)行滴度標(biāo)定，平均滴度為7.852 LgCCID50／mL，CV為1.40%。用該毒株對(duì)12份CA6小鼠免疫血清和12份自然感染人血清進(jìn)行6次中和抗體效價(jià)檢測(cè)，中和抗體效價(jià)的MAX／MIN均 ＜4，CV均 ＜13%，表明該毒株具有良好的適用性，可用于臨床前免疫原性研究中小鼠血清中和抗體效價(jià)測(cè)定，也有望應(yīng)用于臨床研究中人血清中和抗體效價(jià)測(cè)定。

綜上所述，該CA6候選檢測(cè)毒株可作為CA6中和抗體效價(jià)測(cè)定方法的檢測(cè)毒株，但本研究未進(jìn)行CA6中和抗體效價(jià)檢測(cè)方法的驗(yàn)證，今后將進(jìn)行深入研究。本研究為CA6單價(jià)疫苗或多價(jià)疫苗的質(zhì)量控制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。