井匯源綜述，段二珍審校

1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南工業(yè)大學生物工程學院，河南 鄭州 450001

病毒通過進化可在細胞內(nèi)實現(xiàn)自身基因的高效表達，并激活免疫反應，使其成為疫苗研發(fā)中抗原的理想遞送載體。由于甲病毒載體能夠穩(wěn)定攜帶外源基因，且誘導插入突變的概率極低，已成為重要的病毒載體疫苗平臺。甲病毒（alphavirus）屬于披膜病毒科（Togaviridae），以蚊為媒介傳播，對馬和人類致病，主要導致發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎和腦炎［1］。根據(jù)分布的地理位置和所致疾病，甲病毒分為舊大陸（Old World，OW）和新大陸（New World，NW）兩個亞群。OW亞群甲病毒感染后，臨床癥狀以發(fā)熱、皮疹和關(guān)節(jié)炎為特征，稱為關(guān)節(jié)炎型，其成員主要包括辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SINV）、羅斯河病毒（Ross river virus）、塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等［2］；致病性較強的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV）、東方馬腦炎病毒（Eastern equine encephalitis virus，EEEV）、西方馬腦炎病毒（Western equine encephalitis virus，WEEV）則屬于NW亞群甲病毒，稱為腦炎型，感染后導致發(fā)熱和腦脊髓炎，病死率分別為＜1%、50%～78%和3%～7%，神經(jīng)后遺癥發(fā)生率分別為14%、75%和90%［3］。因此，基于甲病毒載體的疫苗主要以SINV、SFV、VEEV的減毒或不致病的毒株為骨架改造而來。由于病毒具備復制的特性，使攜帶的抗原基因得以進一步擴增，從而提升抗原的表達水平；擴增過程中形成的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)可與模式識別受體結(jié)合，激活樹突細胞，因此這類疫苗本身即為天然佐劑［4］，甲病毒載體也可作為抗體的遞送載體用于提供被動免疫保護［5］?；诩撞《据d體的獸用疫苗在動物體內(nèi)可產(chǎn)生良好的免疫效果，該載體上存在甲病毒RNA聚合酶的基因，可模擬病毒的復制，因此攜帶的抗原基因在表達量、持續(xù)時間、免疫效果方面均優(yōu)于亞單位疫苗、滅活疫苗和傳統(tǒng)的DNA／RNA疫苗。本文就甲病毒作為抗原遞送載體在獸用疫苗中應用的研究進展作一綜述，重點闡述基于甲病毒載體疫苗的分類和特征，以期為新型獸用疫苗的研發(fā)提供參考。

1 甲病毒蛋白編碼模式及生物學功能

甲病毒基因組全長11 000～12 000 bp，為單股正鏈RNA，包含2個開放閱讀框，分別編碼非結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)蛋白前體［6］。在結(jié)構(gòu)蛋白中，Capsid基因為病毒衣殼主要成分，E1和E2形成二聚體位于病毒粒子囊膜，參與細胞表面受體識別，并介導病毒囊膜與細胞膜的融合和病毒基因組釋放［7-8］。病毒基因組可直接作為mRNA翻譯形成非結(jié)構(gòu)蛋白前體nsP1～3，并通過read-through位于nsP3上的終止密碼子，翻譯形成第2個非結(jié)構(gòu)蛋白前體nsP1～4。位于非結(jié)構(gòu)蛋白前體的nsP2 C-端區(qū)域具有木瓜樣蛋白酶活性，通過反式切割作用形成nsP4單體，經(jīng)順式切割作用形成nsP1單體，而nsP2～3的分離則既有反式切割又有順式切割作用［3］。nsP1蛋白具備甲基轉(zhuǎn)移酶和鳥苷?；D(zhuǎn)移酶活性，除了負責病毒mRNA的加帽過程外，還可進行棕櫚?；揎棧瑥亩鴮椭茝秃象w靶向至膜結(jié)構(gòu)表面，以協(xié)助RNA合成［9-10］。nsP2能夠干預細胞凋亡、自噬、RNA加工、轉(zhuǎn)運、翻譯等多條細胞信號轉(zhuǎn)導，這與其解旋酶、磷酸酶和蛋白酶活性有關(guān)［11-12］。nsP3包含N-末端macro結(jié)構(gòu)域和甲病毒獨特結(jié)構(gòu)域，在NW和OW亞群甲病毒中高度保守，與復制密切相關(guān)［13-15］。nsP4是RNA依賴的RNA聚合酶，在復制復合體中負責負鏈基因組、基因組及26s亞基因組的合成［16-17］。由nsP1至nsP4組成的復制子是甲病毒載體疫苗的功能核心。甲病毒的基因組和蛋白合成過程見圖1。

圖1 甲病毒的基因組及蛋白合成示意圖Fig.1 Schematic profile of synthesis of alphavirus genome and protein

2 基于甲病毒載體的疫苗分類

根據(jù)抗原遞送的策略和依賴的啟動子不同，可將基于甲病毒載體的疫苗分為質(zhì)粒型DNA疫苗（plasmid DNA-based vaccine）、自我復制型mRNA疫苗（self-amplifying mRNA vaccine，SAM）和病毒樣囊泡疫苗（virus-like vesicles vaccine，VLV）［18-20］。

2.1 質(zhì)粒型DNA疫苗 基于甲病毒的核酸疫苗與減毒活疫苗類似，在體內(nèi)可有效激活免疫應答并提供長期免疫保護［21］。通過在甲病毒復制必須基因之前添加真核細胞的RNA聚合酶Ⅱ啟動子（如CMV啟動子），可確保質(zhì)粒型DNA疫苗進入細胞核后轉(zhuǎn)錄形成甲病毒基因組RNA，而26s亞基因組啟動子則調(diào)控抗原基因的表達［22］。由于結(jié)構(gòu)基因缺失，該疫苗不會包裝子代病毒顆粒，安全性好，也稱自殺性DNA疫苗（suicidal DNA vaccine）［23］?；谫|(zhì)粒型DNA疫苗能實現(xiàn)單次注射遞送多種抗原基因，抗原編碼區(qū)部分可根據(jù)流行毒株序列進行靈活替換，且不影響整個質(zhì)粒分子的物理特性。但質(zhì)粒的入核效率可極大影響疫苗的免疫效果，這是由于質(zhì)粒DNA必須進入動物細胞核才能完成抗原基因的mRNA轉(zhuǎn)錄［18］。另外，質(zhì)粒型DNA疫苗上存在的抗生素抗性基因及甲病毒非結(jié)構(gòu)基因的表達產(chǎn)物對細胞正常生理過程的影響也較大，如LIU等［24］報道，病毒蛋白對宿主干擾素信號通路存在調(diào)控作用。

2.2 SAM mRNA疫苗分為傳統(tǒng)的非復制mRNA疫苗和SAM，一項針對兩種疫苗的對比試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25 μg長度約9 300 nt的流感病毒SAM疫苗與80 μg長度約2 200 nt的傳統(tǒng)mRNA疫苗對H1N1 PR8株攻毒的保護效果相當［19］。SAM疫苗通常包含帽子結(jié)構(gòu)、5′非編碼區(qū)（UTR）、病毒復制必須基因部分（如nsP1～4）、抗原編碼區(qū)部分、3′UTR和polyA尾［25］。SAM通常以正鏈RNA病毒中的甲病毒、黃病毒和小RNA病毒為骨架，其中甲病毒研究的最為透徹。利用線性化質(zhì)粒上T3、T7或SP6啟動子進行體外轉(zhuǎn)錄的方式進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，不依賴真核細胞培養(yǎng)，極大降低了疫苗成本［26］。借助脂質(zhì)納米顆粒遞送100 ng的SAM至小鼠體內(nèi)，即可激活T細胞和B細胞免疫應答，可實現(xiàn)單個細胞表達超過105個拷貝的抗原mRNA，抗原蛋白于3 d后達到表達高峰，表達持續(xù)時間超過14 d［4］。目前，核酸疫苗體內(nèi)遞送效率低，針對大型動物免疫效果不佳，限制了該疫苗的發(fā)展。

2.3 VLV VLV又稱復制限制性病毒樣顆粒（replication restricted virus-like particle）或自我增殖型雜合復制子（self-propagating hybrid replicon particle），在形態(tài)大小和生物學功能上與病毒類似，感染細胞的效率更高，靶向性更好，也克服了核酸疫苗面臨的不穩(wěn)定性和體內(nèi)遞送效果不佳的難題［27］。VLV拯救基于反向遺傳學和感染性克隆技術(shù)，且基因序列來源于2個及2個以上的親本病毒，因此基于甲病毒的VLV通常分為兩類：復制缺陷型（replicationdeficient）和復制完全型（replication-proficient）。復制缺陷型VLV的拯救過程依賴抗原表達質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒，成熟的VLV僅裝配甲病毒nsP1-4基因和抗原基因構(gòu)成的雜合基因組，缺少結(jié)構(gòu)基因，安全性好［28］。復制完全型VLV的拯救不依賴反式提供結(jié)構(gòu)基因，成熟的VLV雜合基因組包含甲病毒nsP1～4基因、抗原基因和結(jié)構(gòu)蛋白基因［20］。早期提供的反式結(jié)構(gòu)基因通常來源于甲病毒自身，隨后研究發(fā)現(xiàn)，彈狀病毒科水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）和狂犬病病毒（rabies virus，RABV）的G基因能夠替代甲病毒的結(jié)構(gòu)基因，完成基因組包裝及成熟VLV顆粒對細胞膜的吸附和膜融合等過程［29］。幼鼠和成鼠實驗顯示，表達RABV G蛋白的VLV毒力大幅降低，與當前使用的減毒活疫苗比較，VLV誘導腦組織炎癥反應、細胞凋亡水平、實驗動物體重下降程度和死亡率均明顯降低［29］。VSVG蛋白對細胞具有泛嗜性，包裹VSVG的VLV可進一步擴大疫苗的宿主范圍。3種基于甲病毒疫苗的特點見表1。

表1 3種基于甲病毒疫苗的特點Tab.1 Characteristics of three vaccines based on alphavirus

3 基于甲病毒載體疫苗的特征

3.1 宿主范圍廣泛 甲病毒載體的一個特征在于其宿主范圍廣泛。甲病毒的自然宿主是馬，但甲病毒載體可用于包括偶蹄動物在內(nèi)多種動物疫苗的研發(fā)。如基于SFV復制子的pSCA1載體，WANG等［23］開發(fā)了針對綿陽和山羊小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）的質(zhì)粒型DNA疫苗，攜帶PPRV fusion基因，經(jīng)肌肉注射BALB／c小鼠，間接ELISA法檢測到特異性中和抗體，且初次免疫24 h后，IL-2、IL-10、IFNγ和TNF-α水平逐步升高；HOSSAIN等［30］利用基于VEEV載體的表達質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒構(gòu)建了表達牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）E基因的VLV，免疫血清中抗體含量IgG＞IgM＞IgA；MURGIA等［31］報道了針對基因Ⅰ型非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的VLV，以VEEV為載體，攜帶ASFV抗原基因p30、p54和p72。肌肉注射2 mL含（2～4.5）×107個甲病毒復制顆粒（replicon particles），ELISA結(jié)果顯示，加強免疫2周后，血清中可檢測到p30抗體，p30蛋白第111～130位氨基酸是抗體識別的重要抗原表位。另外，甲病毒疫苗也可用于寵物和禽類疫苗的開發(fā)。一項采用SINV載體表達犬細小病毒VP2蛋白的DNA疫苗免疫試驗研究中，免疫后犬血清中可檢測到特異性抗體、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞［22］。在另一項鴨群攻毒保護試驗中，構(gòu)建表達了鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）E蛋白的重組SFV載體DNA疫苗，間隔2周經(jīng)肌肉注射7日齡雛鴨，200 μg質(zhì)粒 ／只，4周后血清中和抗體水平達最高峰，DNA疫苗免疫組的PBMC增殖、IL-4和IFNγ水平顯著高于滅活疫苗免疫組；加強免疫2周后，采用強毒株AH-F10進行攻毒保護試驗，DNA疫苗免疫可為鴨群提供完全免疫保護，而滅活疫苗組仍有部分實驗動物死亡［21］。上述研究顯示，甲病毒載體疫苗應用宿主廣泛，具有廣闊的應用前景。

3.2 抗原兼容性 甲病毒載體的另一個特征在于其抗原兼容性好。HOSSAIN等［30］研究表明，插入VEEV載體的BVDV E抗原蛋白為二型膜融合蛋白，基因大小約為1 100 bp?；跍p毒VEEV TC-83株復制子的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）mRNA疫苗中，載體兼容的SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株S蛋白為Ⅰ型膜融合蛋白，基因大小超過3 600 bp，經(jīng)肌肉注射C57BL／6小鼠1～10 μg RNA 14 d后，ELISA法檢測S蛋白特異性抗體水平達109～200 μg／mL，50%抑制濃度達1∶226～1∶643，IgG2c水平高于IgG1，表明該疫苗激活了Th1免疫應答；同時該疫苗在非人靈長類實驗中可誘導強烈的抗體反應，持續(xù)時間至少70 d，中和抗體水平與SARS-CoV-2感染者康復血清中含量相當［25］。同樣基于VEEV TC83株骨架，JOHASON等［32］借助編碼E基因和Capsid基因的輔助質(zhì)粒，將馬秋波病毒和胡寧病毒的GPC基因構(gòu)建至VEEV載體基因組，豚鼠實驗表明，該疫苗能夠同時抵御兩種病毒的感染，該研究為甲病毒載體同時兼容兩種膜蛋白提供了證據(jù)。ZHANG等［33］將VEEV的結(jié)構(gòu)基因替換為RABV G基因，構(gòu)建了雜合型VEEV-RABV病毒，在BHK-21細胞中培養(yǎng)最高滴度達106pfu／mL，囊泡大小60～90 nm，球形而非子彈狀，表明屬于Ⅲ型膜融合蛋白的RABV G蛋白具備包裝甲病毒基因組的功能；在致死劑量的小鼠顱內(nèi)攻毒實驗中，肌肉注射該疫苗誘導產(chǎn)生的中和抗體可提供完全的免疫保護。

4 基于甲病毒的豬瘟疫苗

目前，豬瘟疫苗是基于甲病毒載體的獸用疫苗中研究最多的。2007年，LI等［34］以SFV為載體構(gòu)建表達豬瘟病毒E2蛋白的自殺性DNA疫苗，8周齡仔豬經(jīng)肌肉注射600 mg，間隔3周加強免疫2次，4周后進行石門毒株攻毒試驗，中和抗體水平的平均值達1∶422.4，可提供完全免疫保護；當該DNA疫苗注射劑量減少至100 mg時，免疫動物除了短期發(fā)熱和低水平病毒血癥外，無其他臨床癥狀，依然能夠產(chǎn)生高水平的中和抗體；進一步研究發(fā)現(xiàn)，該DNA疫苗在小鼠體內(nèi)誘導了豬瘟病毒特異性的淋巴細胞增殖及細胞因子表達［35］。

在免疫策略方面，豬瘟病毒E2蛋白的DNA疫苗初次免疫后，與采用桿狀病毒表達的重組E2蛋白比較，采用表達E2蛋白的腺病毒載體加強免疫時，BALB／c小鼠不僅產(chǎn)生了高水平的抗體，還更強地誘導了CD8+和CD4+T細胞增殖及IFNγ的表達水平［36］。在石門毒株攻毒試驗中，采用DNA疫苗初次免疫、腺病毒載體疫苗加強免疫的策略，未出現(xiàn)任何臨床癥狀和病毒血癥，而單純免疫腺病毒載體疫苗則達不到該效果［37］。SUN等［38］進一步構(gòu)建了腺病毒遞送表達E2蛋白的甲病毒復制子rAdV-SFV-E2，結(jié)果表明，2次免疫劑量為6.25×105TCID50或單次免疫劑量為107TCID50均能夠提供完全的免疫保護。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，與傳統(tǒng)疫苗比較，基于甲病毒載體的疫苗具備諸多優(yōu)勢，目前基于VEEV載體的艾滋病病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗及腫瘤疫苗均已應用于臨床醫(yī)學實驗，為基于甲病毒的獸用疫苗開發(fā)提供了依據(jù)。在影響疫苗免疫效果的諸多因素中，佐劑的選擇至關(guān)重要，TIAN等［39］發(fā)現(xiàn)，電穿孔技術(shù)及豬IL-2表達質(zhì)粒與DNA疫苗結(jié)合使用，免疫效果更佳。未來，隨著抗原、載體和佐劑的不斷優(yōu)化，必將促進更多基于甲病毒載體獸用疫苗的研發(fā)和應用［40-41］。