張杰

（蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，安徽蚌埠233000）

丙氨酰谷氨酰胺是L-谷氨酰胺與L-丙氨酸縮合而成的二肽，丙氨酰谷氨酰胺注射液是腸外營養(yǎng)劑，主要用于需要進(jìn)行腸外營養(yǎng)支持的患者，它的主要成分是丙氨酰谷氨酰胺，可以在體內(nèi)分解為谷氨酰胺和丙氨酸。雙肽分解釋放出來的氨基酸可以作為營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存在身體的相應(yīng)部位，并且隨著人體的需要進(jìn)行代謝。對(duì)于許多病癥來說，應(yīng)用腸外營養(yǎng)支持時(shí)，病人可能容易出現(xiàn)谷氨酰胺的耗竭。因此，這個(gè)藥物就可以為患者補(bǔ)充谷氨酰胺，防止患者谷氨酰胺的缺乏。

本文參考2020版《中國藥典》（二部）中丙氨酰谷氨酰胺注射液分析方法，并對(duì)此方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，符合2020版《中國藥典》的要求。此方法操作簡單方便，利用對(duì)照品外標(biāo)法對(duì)主成分含量進(jìn)行定量檢測，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)。

1 驗(yàn)證內(nèi)容

筆者對(duì)此法開展了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，包括系統(tǒng)適用性、線性和范圍、準(zhǔn)確度、精密度、溶液穩(wěn)定性和耐用性，驗(yàn)證結(jié)果見表1。

表1 含量測定方法驗(yàn)證結(jié)果

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；沃特世2489高效液相色譜儀，沃特世公司；Delta320酸度計(jì)，梅特勒-托利多公司。

丙氨酰谷氨酰胺注射液，批號(hào)為2117050501，安徽豐原藥業(yè)股份有限公司；丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品，純度99.1%，批號(hào)1071383，BACHEM；D-丙氨酰-L-谷氨酰胺（雜質(zhì)Ⅴ），純度98.9%，批號(hào)1062310，BACHEM；乙腈，色譜純，DIKMA；磷酸二氫鉀和磷酸，分析純，國藥集團(tuán)；水，純凈水，屈臣氏。

1.2 測定方法

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用氨基鍵合硅膠為填充劑；以0.05 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0）-乙腈（35∶65）為流動(dòng)相；檢測波長為215 nm，流速為0.7 mL/min；柱溫為30℃。取D-丙氨酰-L-谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中含D-丙氨酰-L-谷氨酰胺10μg和丙氨酰谷氨酰胺50μg的混合溶液，取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)按丙氨酰谷氨酰胺峰計(jì)算不低于3 000，D-丙氨酰-L-谷氨酰胺峰與丙氨酰谷氨酰胺峰的分離度應(yīng)符合要求。

測定法：精密量取本品適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中含丙氨酰谷氨酰胺約0.05 mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品適量，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2 分析與討論

2.1 系統(tǒng)適用性

系統(tǒng)適用性溶液：取D-丙氨酰-L-谷氨酰胺（雜質(zhì)Ⅴ）和丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中含D-丙氨酰-L-谷氨酰胺10μg和丙氨酰谷氨酰胺50μg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

取系統(tǒng)適用性溶液20μL連續(xù)注入液相色譜儀，計(jì)算峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

表2 含量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 線性與范圍

取丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品100 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，并定容至刻度，搖勻，作為貯備液；精密量取貯備液2.5 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①②③④⑤。精密量取上述線性溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性圖見圖1，結(jié)果見表3。

圖1 丙氨酰谷氨酰胺線性圖

表3 含量線性與范圍試驗(yàn)結(jié)果

2.3 準(zhǔn)確度

對(duì)照品溶液：精密量取線性與范圍中配制的貯備液5.0 mL，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：精密量取貯備液5.0 mL置于100 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為中濃度溶液（100%），配制三份。同法配制80%低濃度溶液、120%高濃度溶液各三份。

分別取上述溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。測定結(jié)果見表4。

表4 含量準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度

2.4.1 重復(fù)性

對(duì)照品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，搖勻。

供試品溶液：精密量取供試品適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，搖勻。同法制備6份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。測定結(jié)果見表5。

表5 含量測定重復(fù)性結(jié)果

2.4.2 中間精密度

由另一分析人員在不同的儀器上進(jìn)行測試。對(duì)照品溶液和供試品溶液的配制同重復(fù)性中對(duì)照品溶液和供試品溶液的配制。測定結(jié)果見表6。

2.5 溶液穩(wěn)定性

供試品溶液：精密量取供試品適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，搖勻。將此供試品溶液在室溫下放置24 h，并分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h和24 h取樣測定，考查室溫放置24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算主峰保留時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果見表7。

表6 含量測定中間精密度結(jié)果

表7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 耐用性

改變不同的色譜分析參數(shù)，考查色譜條件的耐用性。

對(duì)照品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，搖勻。

供試品溶液：精密量取供試品適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，搖勻。

2.6.1 不同色譜柱

精密量取上述溶液各20μL，分別考查不同色譜柱條件下測得的含量數(shù)據(jù)。不同色譜柱測定的結(jié)果見表8。

表8 不同色譜柱試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 不同檢測波長

精密量取上述溶液各20μL，分別考查不同色譜柱、不同柱溫條件下測得的含量數(shù)據(jù)。檢測波長變化±5 nm，結(jié)果見表9。

表9 波長變化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.3 不同柱溫

精密量取上述溶液各20μL，分別考查不同柱溫條件下測得的含量數(shù)據(jù)。柱溫變化±5℃，結(jié)果見表10。

2.6.4 不同流速

精密量取上述溶液各20μL，分別考查不同流速條件下測得的含量數(shù)據(jù)。流速變化±0.1 mL/min，結(jié)果見表11。

表10 柱溫變化試驗(yàn)結(jié)果

表11 流速變化試驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，采用不同色譜柱，改變檢測波長、柱溫和流速等條件，含量的RSD（n=6）值均小于2.0%，表明本方法的耐用性良好。

3 結(jié)束語

本文經(jīng)試驗(yàn)說明方法的合理性，結(jié)合現(xiàn)行版《中國藥典》中藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，對(duì)此方法進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證，且符合分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求，能夠準(zhǔn)確檢出丙氨酰谷氨酰胺注射液的含量。