方倩囡，宋德安，孔凡玉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101）

1972年，美國(guó)雪佛龍公司研究開發(fā)了一種新型有機(jī)磷農(nóng)藥——乙酰甲胺磷（acephate），此后，乙酰甲胺磷在世界范圍內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化量產(chǎn)，現(xiàn)已成為世界上銷售量最大的十種有機(jī)磷農(nóng)藥之一[1]。作為高毒農(nóng)藥甲胺磷的替代品，乙酰甲胺磷是一種高效、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)的廣譜型殺蟲劑，能明顯抑制蚜科（煙草蚜蟲、小麥芽蟲）、鱗翅目（番茄斜紋夜蛾、棉花棉鈴蟲、茶樹茶尺蠖、玉米螟）、膜翅目（杜鵑三節(jié)葉蜂、黃連木種子小蜂）等害蟲對(duì)農(nóng)作物的危害[2-3]。乙酰甲胺磷純品的大鼠急性經(jīng)口半數(shù)致死量為823 mg/kg，工業(yè)品的大鼠急性經(jīng)口半數(shù)致死量為945 mg/kg，其毒性僅為甲胺磷的1/50[4]。

酸堿解離常數(shù)（pKa）又稱解離平衡常數(shù)，定義為在一定溫度下弱電解質(zhì)達(dá)到電離平衡狀態(tài)時(shí)，已解離的離子濃度的乘積與未解離分子濃度的比值。酸堿解離常數(shù)是與農(nóng)藥溶解度和pH值密切相關(guān)的理化常數(shù)，也是探究農(nóng)藥酸堿性等理化性質(zhì)的重要信息[5-6]，在評(píng)價(jià)其對(duì)環(huán)境和人體健康的影響方面具有十分重要的意義。測(cè)定化學(xué)物質(zhì)解離常數(shù)的方法目前主要有以下幾種：①紫外分光光度法；②電泳法；③熒光法；④電導(dǎo)率法；⑤電位滴定法。紫外分光光度法操作簡(jiǎn)單、方便快捷，精密度高且重現(xiàn)性好，后期數(shù)據(jù)處理方便，特別適用于弱酸（堿）性物質(zhì)解離常數(shù)的測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)紫外分光光度法測(cè)定解離常數(shù)（pKa）的原理，首次采用紫外分光光度法及A-pH曲線法結(jié)合Sigmoidal數(shù)理模型擬合分段測(cè)定了乙酰甲胺磷的pKa1和pKa2值，并從分子基團(tuán)的角度解釋其水解特性，對(duì)指導(dǎo)乙酰甲胺磷的合理使用，評(píng)價(jià)其環(huán)境安全性以及減少對(duì)環(huán)境的負(fù)面效應(yīng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

水溶性農(nóng)藥在水溶液體系中可以發(fā)生電離，以弱酸類農(nóng)藥HZ為例，將HZ溶解到水中，形成HZ穩(wěn)定水溶液，HZ在水中達(dá)到電離平衡狀態(tài)HZ=H＋＋Z-，因此HZ在水溶液中解離常數(shù)，此等式兩邊同時(shí)取負(fù)對(duì)數(shù)，得到酸堿解離常數(shù)計(jì)算公式。

式中：HZ為共軛酸，Z-為共軛堿。

紫外分光光度法測(cè)定農(nóng)藥的pKa具有一定條件要求：首先HZ和Z-均有紫外吸收，用紫外分光光度計(jì)可以測(cè)得具體數(shù)值；另外在同一酸堿條件下HZ和Z-的紫外吸收光譜呈現(xiàn)出明顯的差異性。實(shí)際測(cè)定時(shí)，配置一系列濃度相等的農(nóng)藥水溶液，通過(guò)酸堿溶液KOH和HCl調(diào)節(jié)以上溶液體系的pH值：①將一部分農(nóng)藥溶液pH值調(diào)節(jié)到7左右，讓溶液中的農(nóng)藥以HZ和Z-兩種形式存在；②用HCl將另一部分農(nóng)藥溶液pH值調(diào)節(jié)至酸性條件，此時(shí)水溶液中的農(nóng)藥主要以HZ的形式存在；③用KOH將另一部分農(nóng)藥溶液pH值調(diào)節(jié)至堿性條件，此時(shí)水溶液中的農(nóng)藥主要以Z-的形式存在。設(shè)農(nóng)藥的濃度為C，溶液中HZ的濃度為CHZ，Z-的濃度為CZ-。Abase是堿性條件下的吸光度，Aacid是酸性條件下的吸光度，Aobs是中性條件下的吸光度。如果HZ與Z-的紫外吸收均符合吸收定律，那么：

根據(jù)式（2）即可計(jì)算出農(nóng)藥的pKa值[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

SPECORD200型紫外分光光度計(jì)，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠，使用前在pH值4.00、6.86和9.18處校準(zhǔn)；乙酰甲胺磷（純度99%）；KOH、HCl和KCl均為分析純，北京國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

乙酰甲胺磷溶液的配制：稱取乙酰甲胺磷原藥0.018 3 g，置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容，即得到濃度為1 mmol/L的乙酰甲胺磷溶液。

緩沖溶液：0.1 mol/L HCl與0.1 mol/L NaOH溶液按不同的比例進(jìn)行混合，制備成pH值為2.87～8.12的一系列溶液，加入乙酰甲胺磷溶液中，并加入2 mol/L KCl溶液0.25 mL控制離子強(qiáng)度。

分別將不同pH值的乙酰甲胺磷溶液置于1 cm吸收池中，以對(duì)應(yīng)的pH值溶液做空白對(duì)照，在210～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得到不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的紫外吸收光譜。選擇合適波長(zhǎng)處測(cè)定不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的吸光度值，利用Origin 9.0軟件擬合曲線求出乙酰甲胺磷的解離常數(shù)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選定

圖1為不同pH值條件下乙酰甲胺磷溶液的210～250 nm紫外吸收光譜圖，可以看出pH值為2.21～4.98的溶液的紫外吸收光譜基本重合，可以認(rèn)為pH值在4.98以下，乙酰甲胺磷基本上以分子形式存在；pH值為9.61～12.13的緩沖溶液的紫外吸收光譜基本重合，可以認(rèn)為pH值在9.61以上，乙酰甲胺磷基本上以離子形式存在；pH值為4.98～9.61，乙酰甲胺磷一部分以分子狀態(tài)存在，一部分以離子狀態(tài)存在。

圖1 乙酰甲胺磷在不同pH值的緩沖溶液中的紫外吸收光譜

乙酰甲胺磷在波長(zhǎng)210 nm、217 nm和230 nm處隨pH值的變化，曲線呈現(xiàn)規(guī)律性變化，因此可以選擇這3個(gè)波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。

將210 nm、217 nm和230 nm波長(zhǎng)處不同pH值下乙酰甲胺磷溶液的吸光度繪制成圖2，于210 nm和217 nm處可以觀測(cè)曲線有3個(gè)拐點(diǎn)，所以乙酰甲胺磷有2個(gè)pKa值。

圖2 3個(gè)波長(zhǎng)下不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的吸光度

2.2 乙酰甲胺磷一級(jí)解離常數(shù)（pKa1）的測(cè)定

由圖2可知，乙酰甲胺磷有2個(gè)pKa值。根據(jù)3個(gè)波長(zhǎng)下不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的吸光度，利用Origin 9.0軟件以pH值為橫坐標(biāo)，以不同pH值對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，以Sigmoidal數(shù)理模型擬合曲線方程，求得pKa。

對(duì)于pKa1，擬合曲線方程：

其中，Abase、Aacid、x都在圖2中可知，將數(shù)據(jù)輸入擬合曲線方程中，利用Origin 9.0分析可得乙酰甲胺磷的解離常數(shù)pKa1。根據(jù)圖2，選擇3個(gè)波長(zhǎng)處的pH值為2～12的吸光度值進(jìn)行Sigmoidal數(shù)理模型擬合，得到圖3、圖4和圖5。

圖3 波長(zhǎng)210 nm處Sigmoidal數(shù)理模型擬合A-pH曲線

圖4 波長(zhǎng)217 nm處Sigmoidal數(shù)理模型擬合A-pH曲線

圖5 波長(zhǎng)230 nm處Sigmoidal數(shù)理模型擬合A-pH曲線

由圖3、圖4和圖5模擬分析結(jié)果可得，當(dāng)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，pKa1值為7.483 65，相關(guān)系數(shù)為0.990 68；當(dāng)波長(zhǎng)為217 nm時(shí)，pKa1值為7.422 60，相關(guān)系數(shù)為0.992 07；波長(zhǎng)為230 nm時(shí)，pKa1值為7.497 55，相關(guān)系數(shù)為0.973 93；所得的pKa1值比較可靠。求得乙酰甲胺磷解離常數(shù)的平均值pKa1為7.467 93。

2.3 乙酰甲胺磷二級(jí)解離常數(shù)（pKa2）的測(cè)定

對(duì)于pKa2，由于pH值大于12.5的數(shù)值難以在實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得，所以曲線采用賦值測(cè)試的方法進(jìn)行擬合。選取210 nm處pH值大于9.4的數(shù)據(jù)進(jìn)行賦值擬合，設(shè)初始值A(chǔ)acid=1，Abase=3，曲線擬合結(jié)果見圖6。

圖6 波長(zhǎng)210nm處Sigmoidal數(shù)理模型擬合A-pH曲線

由圖6模擬分析結(jié)果可得，在pH值為9.5～12.5時(shí)，波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，pKa2值為12.778 3，相關(guān)系數(shù)為0.998 71。

2.4 理論分析乙酰甲胺磷解離常數(shù)的合理性

乙酰甲胺磷的水解位點(diǎn)見圖7。乙酰甲胺磷的分子結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)可能的水解位點(diǎn)，包括磷酸基、仲氨基、羰基。其中對(duì)于仲氨基來(lái)說(shuō)，其具有較多的取代基，在誘導(dǎo)效應(yīng)與位阻效應(yīng)的雙重作用下，較難發(fā)生水解。因此，仲氨基的水解常數(shù)一般在10以上。這與本實(shí)驗(yàn)中pKa2值為12.778 3的結(jié)果基本吻合，故可以推測(cè)乙酰甲胺磷的第2個(gè)水解常數(shù)應(yīng)發(fā)生在仲氨基。比較而言，磷酸基較易發(fā)生水解反應(yīng)，且一般在中性pH值附近，因此可將乙酰甲胺磷的第1個(gè)水解常數(shù)（pKa1值為7.467 93）歸因于磷酸基的水解過(guò)程[9]。而對(duì)于羰基，其孤對(duì)電子難以與質(zhì)子發(fā)生結(jié)合，因此可以認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)的pH值范圍內(nèi)不發(fā)生水解反應(yīng)[10-11]。

圖7 乙酰甲胺磷的水解位點(diǎn)

3 結(jié)論

本研究采用紫外分光光度法及A-pH曲線法結(jié)合Sigmoidal數(shù)理模型擬合分段測(cè)定了乙酰甲胺磷的解離常數(shù)，測(cè)得乙酰甲胺磷的一級(jí)（pKa1）、二級(jí)（pKa2）解離常數(shù)分別為7.467 93、12.778 3。

本實(shí)驗(yàn)選取了3個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)210 nm、217 nm和230 nm，分別計(jì)算在這3個(gè)波長(zhǎng)下乙酰甲胺磷的解離常數(shù)。這3個(gè)波長(zhǎng)下經(jīng)繪圖軟件擬合的曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.95，測(cè)定結(jié)果可靠。

乙酰甲胺磷的分子結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)可能的水解位點(diǎn)：磷酸基、仲氨基和羰基。仲氨基的水解常數(shù)在10以上，這與本實(shí)驗(yàn)中的pKa2值為12.778 3的結(jié)果基本吻合，磷酸基較易在中性pH值附近發(fā)生水解反應(yīng)，因此可與乙酰甲胺磷的一級(jí)解離常數(shù)（pKa1值為7.467 93）相對(duì)應(yīng)。