朱萌，錢(qián)曉慶，林成軍，汪蘭，熊光權(quán)，丁安子，王軍

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，武漢 430064；3.荊州市皇冠調(diào)味品有限公司，湖北 荊州 434000)

魚(yú)醬油，又稱魚(yú)露，其傳統(tǒng)工藝是將低值魚(yú)蝦鹽漬，經(jīng)長(zhǎng)達(dá)一年至幾年的自然發(fā)酵，形成一種呈琥珀色澤、味道鮮咸的調(diào)味品，常用于閩菜、潮州菜和東南亞料理中。為縮短魚(yú)醬油的發(fā)酵周期，多采用降鹽法、保溫法、加酶法和加曲法中的一種或多種方法，從而實(shí)現(xiàn)快速分解原料中蛋白質(zhì)和脂肪、形成特有滋味和風(fēng)味的目的。Klomklao等[1]通過(guò)調(diào)整鹽和鰹魚(yú)內(nèi)臟的添加量制備沙丁魚(yú)魚(yú)醬油，研究發(fā)現(xiàn)減少食鹽用量和添加金槍魚(yú)內(nèi)臟后，可顯著提高蛋白質(zhì)的降解速率以及魚(yú)醬油的品質(zhì)。黃紫燕等[2]采用前期高鹽酶解、中期加曲自然發(fā)酵、后期高鹽保溫的速釀方式，使傳統(tǒng)魚(yú)醬油的發(fā)酵時(shí)間由3年縮短為1年。在速釀魚(yú)醬油的生產(chǎn)方法中，加曲法所添加種曲的酶系較為全面，包含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和糖化酶等，不僅可有效縮短發(fā)酵周期，其產(chǎn)品品質(zhì)也較為優(yōu)異，因而得到廣泛應(yīng)用。種曲常用原料有大豆、豆粕、大米、大麥、小麥和麩皮等。Murakami等[3]研究發(fā)現(xiàn)添加不同原料制備的種曲后，魚(yú)醬油的鮮味均得到提高，其中大豆曲影響魚(yú)醬油的口感，大米曲、大麥曲和小麥曲影響魚(yú)醬油的風(fēng)味，而麩皮曲對(duì)魚(yú)醬油的品質(zhì)影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用麩皮曲混合絞碎魚(yú)肉發(fā)酵制備魚(yú)醬油，并分析發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化。以游離氨基酸含量評(píng)價(jià)麩皮曲魚(yú)醬油的滋味，以固相微萃取(SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)雙色譜柱定性分析評(píng)價(jià)麩皮曲魚(yú)醬油的風(fēng)味，為麩皮曲魚(yú)醬油的工業(yè)化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮鱖魚(yú)：4月份購(gòu)于武漢白沙洲水產(chǎn)市場(chǎng)，條重(500±70) g，帶水運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，宰殺后去鱗、去鰓、去內(nèi)臟并沖洗。采用冷凍絞肉機(jī)將其絞碎，儲(chǔ)存于-18 ℃冰箱中備用。

米曲霉(Aspergillusoryzae，滬釀3.042)：廣東省微生物菌種保藏中心；麩皮、食鹽、面粉等：武商量販農(nóng)科城店；2-甲基-3-庚酮：美國(guó)Sigma公司；其他試劑：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

L-8900氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；57330-U SPME萃取裝置、57348-U萃取頭 美國(guó)Supelco公司；Trace 1310-ISQ LT/Trace Ultra DSQ Ⅱ LT氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麩皮曲魚(yú)醬油的制備

參考趙謀明等[4]的方法，并在前期研究基礎(chǔ)上略做改動(dòng)，麩皮∶面粉按4∶1混勻后于121 ℃滅菌15 min→接種0.05%米曲霉→培養(yǎng)44 h得麩皮曲→魚(yú)泥∶麩皮曲∶鹽∶水按1∶0.5∶0.55∶1.5攪拌均勻→控溫30 ℃發(fā)酵180 d→100目過(guò)濾→90 ℃加熱15 min→-18 ℃冰箱貯藏待測(cè)。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

參考倪海晴[5]的方法，分別在魚(yú)醬油發(fā)酵過(guò)程的第5，10，20，30，60，90，120，150，180天取樣進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定。pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法測(cè)定，還原糖采用比色法測(cè)定，游離氨基酸采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

取發(fā)酵180 d的麩皮曲魚(yú)醬油樣品10 mL，置于50 mL樣品瓶中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)(2-甲基-3-庚酮)，50 ℃恒溫水浴30 min至揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)達(dá)到吸附-釋放平衡。將老化處理后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中萃取40 min，然后將萃取頭插入GC/MS進(jìn)樣器中解吸附5 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

色譜條件參考王娟等[6]的方法：DB-5MS弱極性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，DB-WAX極性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為He，流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；采用程序升溫：起始溫度40 ℃，保持4 min，然后以3 ℃/min升溫至100 ℃，保持10 min，再以6 ℃/min升溫至150 ℃，保持8 min，最后以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為250 ℃；電離方式為EI+；發(fā)射電流為200 μA；電子能量為70 eV；掃描質(zhì)量范圍為35～500 amu。

保留指數(shù)(RI)：在與樣品相同色譜條件下，對(duì)C6～C33正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行GC-MS分析，通過(guò)公式(1)計(jì)算RI值。

(1)

式中：n和n+1為未知化合物前后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；t為未知化合物保留時(shí)間，tn和tn+1為相應(yīng)正構(gòu)烷烴保留時(shí)間(tn+1>t>tn)。

1.3.4 OAV的計(jì)算

采用NIST譜庫(kù)檢索、保留指數(shù)比對(duì)進(jìn)行定性分析；根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度、內(nèi)標(biāo)物的峰面積與目標(biāo)物的峰面積進(jìn)行半定量分析。采用OAV值評(píng)價(jià)各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)樣品總體香氣的貢獻(xiàn)。

OAVi=Ci/Ti。

(2)

式中：Ci、Ti分別為各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量(μg/kg)和相應(yīng)的閾值(μg/kg)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)變化

發(fā)酵過(guò)程中，麩皮曲魚(yú)醬油中氨基酸態(tài)氮含量變化見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化趨勢(shì)Fig.1 The change trend of amino acid nitrogen content during fermentation

氨基酸態(tài)氮含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。從初始至第120天，魚(yú)肉中蛋白質(zhì)在麩皮曲中蛋白酶的作用下酶解生成大量含-NH2的游離氨基酸及小分子肽[7]，氨基酸態(tài)氮含量快速增加，由0.39 g/dL增加至0.78 g/dL，增幅達(dá)100%；從第120～180 d，隨時(shí)間的增加以及pH的降低，蛋白酶逐漸失活，酶解出的游離氨基酸逐漸減少，而美拉德反應(yīng)和嗜鹽微生物代謝消耗的氨基酸逐漸增多[8]，氨基酸態(tài)氮含量逐漸減少，由0.78 g/dL減少至0.64 g/dL，減少了17.9%。

發(fā)酵過(guò)程中，麩皮曲魚(yú)醬油中總酸(以乳酸計(jì))、pH的變化見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中總酸及pH的變化趨勢(shì)Fig.2 The change trend of total acid content and pH during fermentation

總酸含量先增加后減少，從初始至第120天，總酸含量逐漸增加，由0.49 g/dL增至1.17 g/dL，隨后逐漸減少至0.67 g/dL。pH與總酸含量呈相反變化趨勢(shì)，先降低后升高，從初始至第120天，pH降低至5.32，然后升高至5.44。發(fā)酵前期，麩皮中碳水化合物在微生物的作用下生成各種有機(jī)酸(主要是乳酸)，魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)在麩皮曲中蛋白酶的作用下分解成酸性多肽及氨基酸，魚(yú)肉中脂肪水解出游離脂肪酸，從而引起總酸的增加，pH的減少。發(fā)酵后期，酯化反應(yīng)消耗部分有機(jī)酸、脂肪酸[9]，美拉德反應(yīng)和嗜鹽微生物代謝消耗部分氨基酸，從而造成總酸的減少，pH的增加。

發(fā)酵過(guò)程中，麩皮曲魚(yú)醬油中還原糖的變化見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化趨勢(shì)Fig.3 The change trend of reducing sugar content during fermentation

還原糖呈先增加后波動(dòng)減少的趨勢(shì)。在制曲階段，麩皮曲中米曲霉所產(chǎn)生的淀粉酶及糖化酶將淀粉酶解為還原糖，因而發(fā)酵初期還原糖即處于較高濃度。從初始至第30天，淀粉繼續(xù)被酶解為還原糖，還原糖含量逐漸增加；30～60 d，還原糖一部分為嗜鹽微生物增殖提供碳源，另一部分被嗜鹽微生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，還原糖含量迅速減少；60～180 d，淀粉酶和糖化酶繼續(xù)分解淀粉/糊精生成還原糖，同時(shí)美拉德反應(yīng)和嗜鹽微生物生長(zhǎng)消耗部分還原糖，從而造成還原糖含量波動(dòng)減少。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸變化

發(fā)酵過(guò)程中，麩皮曲魚(yú)醬油中游離氨基酸的變化見(jiàn)表1，呈梯度上升趨勢(shì)。從初始至第20天，總游離氨基酸在麩皮曲中蛋白酶的作用下逐漸增加，由33.712 g/L增至47.938 g/L；20～60 d，酶解生成的游離氨基酸與嗜鹽微生物增殖所消耗的氨基酸趨于平衡，總游離氨基酸無(wú)顯著變化；60～90 d，增殖的嗜鹽微生物所分泌的蛋白酶參與酶解，總游離氨基酸增加，由46.490 g/L增至52.671 g/L；90～180 d，酶解所產(chǎn)生的游離氨基酸與美拉德反應(yīng)，嗜鹽微生物代謝所消耗的游離氨基酸趨于平衡，總游離氨基酸無(wú)顯著變化。

表1 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量的變化Table 1 The change of amino acids content during fermentation

續(xù) 表

根據(jù)Tseng等[10]、Zhang等[11]對(duì)氨基酸滋味的描述，可分為鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸)、苦味氨基酸(組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸)和無(wú)味氨基酸(賴氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)。發(fā)酵過(guò)程中，鮮味氨基酸持續(xù)增加，甜味氨基酸和苦味氨基酸與總游離氨基酸呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，含量梯度上升，變化趨勢(shì)與Wang等[12]對(duì)傳統(tǒng)中式魚(yú)露的研究結(jié)果以及高獻(xiàn)禮[13]對(duì)高鹽稀態(tài)醬油的研究結(jié)果一致，但各呈味氨基酸占比不同。本研究的麩皮曲魚(yú)醬油中甜味氨基酸占42.51%(魚(yú)露2.09%，醬油32.26%)，占比顯著增加；苦味氨基酸占33.44%(魚(yú)露41.43%，醬油54.78%)，占比顯著減少；鮮味氨基酸占24.05%(魚(yú)露34.05%，醬油12.58%)，占比低于魚(yú)露高于醬油。較少的苦味氨基酸、較多的甜氨基酸以及鮮味肽、核苷酸和氯化鈉的增效作用使麩皮曲魚(yú)醬油呈強(qiáng)烈的鮮、咸、甜味，與感官體驗(yàn)結(jié)果一致[14-17]。原料中所包含的不同碳、氮源形成不同類型的嗜鹽微生物群落以及差異化的美拉德反應(yīng)途徑，最終使麩皮曲魚(yú)醬油呈現(xiàn)較佳的滋味、品質(zhì)。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

同時(shí)采用2種不同極性的色譜柱(DB-5MS、DB-WAX)對(duì)麩皮曲魚(yú)醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行雙柱定性，通過(guò)NIST譜庫(kù)檢索和RI值比對(duì)，共鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)58種，見(jiàn)表2。其中酸類12種，醛類11種，醇類9種，呋喃9種，酯類5種，酮類5種，含硫化合物3種，苯酚等其他化合物4種。由2種色譜柱鑒定結(jié)果分析可知，酸類、醇類化合物DB-WAX色譜柱鑒定數(shù)量多于DB-5MS色譜柱，醛類、酮類等化合物DB-WAX色譜柱鑒定數(shù)量少于DB-5 MS色譜柱，即極性色譜柱鑒定出更多的極性化合物，弱極性色譜柱鑒定出更多的弱極性化合物，符合相似相溶規(guī)律。因此，采用不同極性色譜柱進(jìn)行雙柱定性分析，其鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確、全面。

表2 魚(yú)醬油揮發(fā)性化合物GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results of volatile compounds in fish sauce

續(xù) 表

OAV值是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃度與其閾值的比值，廣泛用于關(guān)鍵香氣物質(zhì)的篩選，OAV≥1則可認(rèn)為此化合物為關(guān)鍵呈香化合物，OAV值越大，該化合物對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)程度越高。

表3 魚(yú)醬油關(guān)鍵香氣物質(zhì)分析結(jié)果Table 3 Analysis results of key aroma substances in fish sauce

續(xù) 表

由表3可知，麩皮曲魚(yú)醬油中關(guān)鍵香氣物質(zhì)有9種，分別為異戊醛(1093)、異戊醇(59.34)、3-甲硫基丙醛(40.96)、苯乙醛(7.48)、1-辛烯-3-醇(5.38)、壬醛(5.35)、二甲基三硫(4.5)、葵醛(3.9)和正己醇(1.86)。筆者對(duì)麩皮曲魚(yú)醬油進(jìn)行感官體驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)魚(yú)醬油呈麥芽香主導(dǎo)的醬味頭香，體香以花香、甜香為主，殘香類似魚(yú)類脂肪香，與OAV結(jié)果一致。王悅齊等[22]對(duì)傳統(tǒng)中式魚(yú)露的研究表明，香氣貢獻(xiàn)程度較大的物質(zhì)依次為：3-甲硫基丙醛(159.74)、異戊醛(129.71)、1-辛烯-3-醇(69.41)、2-甲基丙醛(21.08)、乙酸乙酯(19.06)等。馮云子[23]對(duì)高鹽稀態(tài)醬油的研究表明，香氣貢獻(xiàn)程度較大的物質(zhì)依次為：異戊醛(460)、HEMF(363)、乙酸乙酯(183)、2-甲基丁醛(167)、3-甲硫基丙醛(101)、2-甲基丙醛(80)、胡蘆巴(43)、2-甲基丁醇(35)、苯乙醛(31)等。從關(guān)鍵香氣組成比例及感官體驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，麩皮曲魚(yú)醬油與高鹽稀態(tài)醬油更為相似。另外，馮云子的香氣缺失實(shí)驗(yàn)還表明異戊醇、苯乙醛的缺失會(huì)導(dǎo)致形成差異顯著的醬油香氣模型，而異戊醇和苯乙醛在麩皮曲魚(yú)醬油和高鹽稀態(tài)醬油關(guān)鍵香氣物質(zhì)中的貢獻(xiàn)均較大，在傳統(tǒng)中式魚(yú)露中的貢獻(xiàn)較小，進(jìn)一步說(shuō)明產(chǎn)品命名為麩皮曲魚(yú)醬油更為合適。

3 結(jié)論

本研究以麩皮和絞碎魚(yú)肉控溫發(fā)酵制備魚(yú)醬油，在180 d的發(fā)酵過(guò)程中，氨基酸態(tài)氮和總酸均呈先增加后減少趨勢(shì)，分別達(dá)0.64，0.67 g/dL；pH與總酸趨勢(shì)正好相反，先減少后增加，至5.44；還原糖呈先增加后波動(dòng)減少趨勢(shì)，達(dá)1.56 g/dL。

游離氨基酸分析結(jié)果表明，麩皮曲魚(yú)醬油總游離氨基酸達(dá)51.427 g/L，其中鮮味氨基酸占24.05%，甜味氨基酸占42.51%，苦味氨基酸占33.44%，較高鹽稀態(tài)醬油和魚(yú)露相比，具有更多的甜味氨基酸和更少的苦味氨基酸，呈現(xiàn)出較佳的滋味品質(zhì)。采用SPME-GC/MS雙色譜柱定性的方法對(duì)麩皮曲魚(yú)醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明雙柱定性分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、全面。結(jié)合香氣活性值(OAV)確定其關(guān)鍵香氣物質(zhì)為異戊醛、異戊醇、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、二甲基三硫、葵醛和正己醇。氨基酸分析和風(fēng)味分析結(jié)果還表明，麩皮曲魚(yú)醬油更類似于高鹽稀態(tài)醬油，與感官體驗(yàn)一致。