栗銘鴻 - 姜伊悅 - 張小勇 - 崔福順, -,

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學(xué)食品研究中心，吉林 延吉 133002)

中國食用菌資源豐富，是食用菌生產(chǎn)大國，產(chǎn)量占世界首位；總產(chǎn)值在國內(nèi)種植業(yè)中居第6位。食用菌含有豐富的蛋白質(zhì)，可與肉、蛋以及豆類相媲美。肽類是介于蛋白質(zhì)與氨基酸之間的一種生化物質(zhì)，分子量比蛋白質(zhì)小，更易被胃腸吸收而具有更多生物活性。食用菌源蛋白肽類的制備、理化性質(zhì)及其免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功能活性已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[1-4]；并已應(yīng)用到功能保健食品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-6]。研究[7-8]也證實(shí)，肽類的功能活性依賴于其分子量大小、氨基酸組成及氨基酸排列順序等。

元蘑是中國東北著名食用菌之一，味道鮮美，營養(yǎng)豐富。元蘑中含有蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)；還含有酚類、多糖等活性成分；具有抗氧化、抗癌、抗輻射等功效作用[9]。目前國內(nèi)外對(duì)元蘑的研究主要集中在元蘑多糖的提取、結(jié)構(gòu)以及生物活性[10-12]，而對(duì)元蘑蛋白的研究鮮見報(bào)道。

課題組[13]12前期研究發(fā)現(xiàn)元蘑中含有多種生物活性成分，具有很好的抗氧化作用。試驗(yàn)擬以元蘑為原料，研究風(fēng)味蛋白酶酶解制備元蘑蛋白肽工藝條件，并分析蛋白肽分級(jí)組分的氨基酸組成、紅外特征及其體外抗氧化活性，為高值化元蘑蛋白產(chǎn)品的開發(fā)及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

元蘑：購于吉林延吉；

風(fēng)味蛋白酶：酶活1∶30 000，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過硫酸鉀、丁基羥基茴香醚(BHA)：分析純，美國Sigma公司；

β-巰基乙醇：純度≥99.0%，卡邁舒(上海)生物科技有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)：TDZ5-WS型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

氨基酸自動(dòng)分析儀：L-8900型，日本日立集團(tuán)；

傅里葉紅外光譜儀：IRTracer-100型，日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)水解度DH測定 參照文獻(xiàn)[14]。

1.3.2 元蘑蛋白質(zhì)提取液制備 準(zhǔn)確稱取脫脂元蘑，以料液比1∶80 (g/mL)利用0.07 mol/L NaOH超聲提取40 min，提取溫度50 ℃，超聲功率250 W；過濾后濾液用鹽酸調(diào)至pH 4.0，4 000 r/min離心20 min；沉淀用蒸餾水復(fù)溶制得元蘑蛋白溶液，作為后續(xù)元蘑蛋白肽制備原液[15]。

1.3.3 酶解制備元蘑蛋白肽單因素試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇風(fēng)味蛋白酶為水解用酶。以水解度和DPPH·清除率為指標(biāo)進(jìn)行單因素考察。

(1) 溫度對(duì)元蘑蛋白酶解效果的影響：固定pH 7.0、風(fēng)味蛋白酶添加量5 000 U/g以及酶解時(shí)間4.0 h，考察溫度分別為40，45，50，55，60 ℃條件下的酶解效果。

(2) pH值對(duì)元蘑蛋白酶解效果的影響：固定酶解溫度50 ℃、風(fēng)味蛋白酶添加量5 000 U/g以及酶解時(shí)間4.0 h，考察pH 7.0，7.5，8.0，8.5，9.0條件下的酶解效果。

(3) 酶解時(shí)間對(duì)元蘑蛋白酶解效果的影響：固定酶解溫度50 ℃、pH 7.0以及風(fēng)味蛋白酶添加量5 000 U/g，考察酶解時(shí)間分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h條件下的酶解效果。

(4) 加酶量對(duì)元蘑蛋白酶解效果的影響：固定酶解溫度50 ℃、pH 7.0以及酶解時(shí)間4.0 h，考察風(fēng)味蛋白酶添加量分別為3 000，4 000，5 000，6 000，7 000 U/g條件下的酶解效果。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶解制備元蘑蛋白肽工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH·清除率為響應(yīng)值，選擇影響相對(duì)較大的因素，采用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酶解制備元蘑蛋白肽工藝條件。

1.3.5 元蘑蛋白肽分級(jí) 將元蘑酶解制得的酶解液在3.5，10.0 kDa透析袋中透析，收集3個(gè)組分，標(biāo)記為P1(<3.5 kDa)、P2(3.5～10.0 kDa)及P3(>10.0 kDa)，分別冷凍干燥，制得元蘑蛋白肽3個(gè)分級(jí)組分。

1.3.6 氨基酸組成分析 稱取樣品置于水解管，加入6 mol/L HCl溶液，真空封口，110 ℃水解24 h后定容；取1 mL在100 ℃水浴蒸干，加2.5 mL 0.02 mol/L HCl溶解后進(jìn)樣測定。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析 稱取樣品2 mg，以質(zhì)量比1∶100加入溴化鉀混合研磨壓片。紅外光譜采集分析軟件為LabSolutions IR，掃描50次，分辨率0.25 cm-1，信噪比60 000∶1，波數(shù)范圍4 500～450 cm-1。

1.3.8 抗氧化活性測定 DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力和相對(duì)還原能力的測定參照文獻(xiàn)[13]11-12。利用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)值法進(jìn)行抗氧化綜合評(píng)價(jià)[16]。

1.3.9 模擬人工胃腸液對(duì)蛋白肽的影響 將元蘑蛋白肽配成0.05 mg/mL溶液，煮沸2 min，冷卻后用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至pH 2.0，加入胃蛋白酶(占底物質(zhì)量的4%)，37 ℃恒溫反應(yīng)1 h；用0.9 mol/L的NaHCO3溶液將pH值調(diào)至5.3，再用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，加入胰蛋白酶(占底物質(zhì)量的4%)，37 ℃恒溫反應(yīng)2.0 h，10 min沸水浴終止反應(yīng)，冷卻后取上清液，測定其DPPH· 清除率并代入式(1)計(jì)算活性保留率[17-19]。

(1)

式中：

B——活性保留率，%；

A1——不同條件處理后樣品的清除率，%；

A0——蛋白肽原液的清除率，%。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析并進(jìn)行LSD多重比較分析；紅外光譜圖采用Origin 6.1軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 元蘑蛋白酶解響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，固定加酶量6 000 U/g，選擇pH、酶解時(shí)間和酶解溫度3個(gè)因素，采用Box-Behnken進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，編碼及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 10軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到模型方程：

Y=26.898-1.464A+0.488B-1.157C+0.445AB-0.114AC+1.376BC-1.946A2-2.427B2-1.176C2。

(2)

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可知，建立的二項(xiàng)多項(xiàng)模型極顯著；失擬項(xiàng)不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.911，說明此模型可以很好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。顯著性表明，一次項(xiàng)A極顯著，C顯著，B不顯著；二次項(xiàng)A2和B2極顯著，C2不顯著；交互項(xiàng)BC顯著，AB和AC不顯著。表明響應(yīng)值的變化較復(fù)雜，各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系；影響的大小順序依次為A>C>B。

圖1為3個(gè)因素影響DPPH·清除能力的響應(yīng)面和等值線圖。通過軟件分析得到的最佳酶解條件為pH 7.60，酶解時(shí)間2.90 h，酶解溫度42.39 ℃，DPPH·清除率理論值可達(dá)27.45%。為了驗(yàn)證上述最佳條件，同時(shí)考慮操作可行性，選擇酶解條件為：pH 7.6，酶解時(shí)間3.0 h，酶解溫度42 ℃，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)得到的DPPH·清除率為26.85%，與理論值基本吻合。

表3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2 氨基酸組成分析

由表4可以看出，元蘑蛋白肽3個(gè)組分中均含有16種氨基酸，其中含有7種必需氨基酸(色氨酸未測)；都不含有半胱氨酸。同時(shí)，3個(gè)組分中谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸相對(duì)豐富，這些氨基酸參與蛋白質(zhì)的代謝過程，有助腦部發(fā)育以及增強(qiáng)肝臟功能、降低血壓等。與FAO推薦標(biāo)準(zhǔn)相比，組分P3中苯丙氨酸和蘇氨酸含量高于FAO推薦標(biāo)準(zhǔn)；纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量與之相當(dāng)，這些氨基酸具有改善記憶力和預(yù)防脂肪肝的作用[20]。葛曉鳴等[7]研究發(fā)現(xiàn)酶解肽的分子量大小不同時(shí)氨基酸組成也不同，抗氧化能力也不同。由表4還可以看出，元蘑蛋白肽3個(gè)組分中組分P3的總氨基酸和必需氨基酸含量最高，顯著高于(P<0.05)組分P1和組分P2。因此，可以推測3個(gè)組分的抗氧化作用也會(huì)存在差異。

2.3 紅外光譜分析

由圖2可看出，P1、P2和P3的峰形和出峰位置基本一致，說明三者具有同樣的官能團(tuán)；3 414 cm-1處的極強(qiáng)吸收峰可能是N—H伸縮振動(dòng)峰，屬伯胺的特征吸收；2 929 cm-1處的吸收峰可能是CH2非對(duì)稱性伸縮振動(dòng)，屬于酰胺B帶；2 368 cm-1可能是三鍵和累積二鍵伸縮振動(dòng)的吸收峰；1 637 cm-1處的強(qiáng)吸收峰可能是酰胺Ⅰ帶(C═O伸縮振動(dòng))的β折疊，酰胺I帶特征峰由多肽骨架的C═O伸縮振動(dòng)在特定的氫鍵環(huán)境下引起的，其對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化十分敏感，是描述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的最主要峰[21]；1 404 cm-1處的吸收峰可能是C—N伸縮振動(dòng)峰，屬酰胺Ⅲ帶；1 249 cm-1處的吸收峰可能屬于蛋白質(zhì)紅外光譜的酰胺Ⅲ帶的β折疊；1 035，1 076 cm-1處的強(qiáng)吸收峰可能是C—N伸縮振動(dòng)峰，屬脂酰胺的特征吸收；638 cm-1處的吸收峰可能是N—H伸縮振動(dòng)峰。

圖1 響應(yīng)面及等值線圖

表4 氨基酸組成?

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 紅外光譜圖

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除作用 如圖3所示，隨著濃度的增加，3個(gè)組分元蘑蛋白肽DPPH·清除能力均隨之增大，濃度與清除率呈正相關(guān)；3個(gè)組分中P3清除能力(72.95%)顯著高于(P<0.05)組分P1和組分P2。劉敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)鰱魚肽經(jīng)超濾分成的3個(gè)組分中分子量大的組分DPPH·清除能力最好，與試驗(yàn)相似。

2.4.2 ABTS+·清除作用 如圖4所示，隨著濃度的增加，3個(gè)組分清除率均隨之增大，濃度與清除率呈正相關(guān)；3個(gè)組分之間組分P3對(duì)ABTS+·清除能力最高(P<0.05)；其次為組分P1，組分P2最低；當(dāng)濃度為10 mg/mL

字母不同表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)

時(shí)，組分P3的清除率最高(97.82%)。申彩紅等[23]發(fā)現(xiàn)海參寡肽中小分子量(0.13～2.00 kDa)具有較好的ABTS+·清除能力；與試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是蛋白來源不同，所用蛋白酶種類也不同，產(chǎn)生的多肽氨基酸序列不同，功能作用亦有差異。

2.4.3 ·OH清除作用 如圖5所示，隨著濃度的增加，3個(gè)組分·OH清除率也增大；濃度與清除率也呈正相關(guān)；3個(gè)組分之間組分P3的清除率顯著高于(P<0.05)組分P2和組分P1。當(dāng)濃度為20 mg/mL時(shí)，組分P3的清除率最高(60.99%)。張會(huì)翠等[24]發(fā)現(xiàn)花生肽3個(gè)組分中大分子量組分對(duì)·OH清除效果最差，與試驗(yàn)結(jié)果不同。說明不同來源蛋白肽分子量大小對(duì)·OH清除作用不同。

字母不同表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.4 元蘑蛋白肽的相對(duì)還原能力 如圖6所示，隨著濃度的增加，3個(gè)組分相對(duì)還原能力也增加，呈明顯的量效關(guān)系。3個(gè)組分中P3的相對(duì)還原能力顯著高于(P<0.05)組分P2和組分P1；組分P2的還原力最差。當(dāng)濃度為20 mg/mL時(shí)，P3組分相對(duì)還原能力達(dá)到97.55%。張會(huì)翠等[24]發(fā)現(xiàn)花生肽3個(gè)組分中低分子量具有較好的還原能力，與試驗(yàn)結(jié)果不同。Aderonke等[25]研究表明，同種物質(zhì)經(jīng)不同種類蛋白酶作用后，由于酶解位點(diǎn)不同，所得到的多肽氨基酸序列不同，產(chǎn)生同樣分子量大小的多肽片段顯現(xiàn)出不同的抗氧化效果。

字母不同表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.5 綜合抗氧化能力 利用隸屬函數(shù)對(duì)不同分子量元蘑多肽抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。以DPPH·、ABTS+·、·OH和相對(duì)還原力4個(gè)指標(biāo)為依據(jù)，計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。經(jīng)計(jì)算不同分子量元蘑多肽隸屬函數(shù)值的平均值從大到小依次為組分P3(0.70)>P1(0.43)>P2(0.19)，說明不同分子量元蘑多肽中組分P3的綜合抗氧化能力最好；其次為組分P1；組分P2最差。

生物活性物質(zhì)的抗氧化能力與疏水性氨基酸和芳香性氨基酸具有較強(qiáng)的相關(guān)性。試驗(yàn)中不同分子量元蘑多肽的疏水性氨基酸和芳香性氨基酸含量較高；3個(gè)組分中組分P3的含量顯著高于(P<0.05)組分P1和組分P2，也印證了組分P3具有最強(qiáng)的抗氧化能力，其次為組分P1，組分P2最差，與綜合抗氧化能力順序相符。但這一結(jié)論與其他學(xué)者[7,24,26]研究結(jié)果小分子肽具有比大分子肽抗氧化活性更好的結(jié)論不同。造成這一結(jié)果的原因，可能是元蘑中所含有的蛋白質(zhì)經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解并透析分級(jí)后的組成不同；也有可能是分級(jí)組分中氨基酸含量的差異；還可能是有其他活性成分在起作用。有待于進(jìn)一步分離純化，并進(jìn)行功能活性驗(yàn)證。

2.5 模擬人工胃腸液對(duì)元蘑蛋白肽穩(wěn)定性的影響

圖7為模擬胃腸道消化對(duì)3個(gè)組分元蘑蛋白肽穩(wěn)定性的影響。經(jīng)過1 h的胃蛋白酶作用后組分P1和組分P3的活性保留率保持在90%以上；組分P2的活性保留率達(dá)到106%。說明經(jīng)過胃蛋白酶作用后，其抗氧化能力反而增強(qiáng)，可能在胃蛋白酶作用下，組分P2得到進(jìn)一步酶解，產(chǎn)生更多具有抗氧化活性的多肽。胃蛋白酶作用后，再利用胰蛋白酶模擬腸道作用2 h，發(fā)現(xiàn)組分P1和組分P3的活性仍可保留在90%以上；而組分P2的活性保留率也在100%以上，說明胰蛋白酶將組分P1和組分P3進(jìn)一步地酶解，抗氧化肽進(jìn)而分解成其他功能肽，抗氧化活性減弱。經(jīng)過模擬胃腸環(huán)境發(fā)現(xiàn)元蘑蛋白肽活性基本沒有影響，并且可以增強(qiáng)組分P2的抗氧化能力，穩(wěn)定性很好。張晶[17]通過模擬胃腸道對(duì)菜籽抗氧化肽發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胃蛋白酶作用后抗氧化活性增強(qiáng)，但經(jīng)胰蛋白酶作用后活性有一定程度上的減弱，活性下降至80%。

字母不同表示不同組分之間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

利用風(fēng)味蛋白酶對(duì)元蘑進(jìn)行酶解制備元蘑蛋白肽，在固定酶用量為6 000 U/g條件下得到最佳酶解工藝為pH 7.6、酶解時(shí)間3.0 h、酶解溫度42 ℃，該條件下酶解液對(duì)DPPH·清除率為26.85%。對(duì)元蘑蛋白肽進(jìn)一步分級(jí)得到的3個(gè)組分P1(<3.5 kDa)、P2(3.5～10.0 kDa)和P3(>10.0 kDa)中均含有多種氨基酸；分子量最大的組分P3含有最多的總氨基酸和必需氨基酸；綜合抗氧化結(jié)果也表明3個(gè)組分中大分子量的組分P3效果最好；清除效果與濃度呈正相關(guān)。同時(shí)還得出元蘑蛋白多肽分子量不同，氨基酸組成以及抗氧化能力也不同；分子量越大，含有疏水性氨基酸和芳香性氨基酸越多，抗氧化效果越好。紅外光譜圖結(jié)果表明，3個(gè)組分峰形和出峰位置基本一致，說明具有相同的官能團(tuán)，二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。模擬胃腸道消化結(jié)果表明，胃消化和腸消化作用對(duì)3個(gè)組分活性基本無影響。綜上可以得出，元蘑蛋白中大分子量的蛋白肽氨基酸種類豐富，穩(wěn)定性好，并具有很好的抗氧化作用，可以作為營養(yǎng)功能成分應(yīng)用到食品加工中。而且食用菌來源不同以及蛋白肽分子量的大小不同時(shí)功能活性也呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。

體外的功效作用并不能完全代表元蘑蛋白肽體內(nèi)的生物活性。下一步將繼續(xù)對(duì)體內(nèi)相關(guān)活性展開深入研究，為元蘑高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。