肖澤華，李欣航，潘高，吳耀文，楊燦鑫，匡雪韶，劉文勝*

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

錳作為植物生長(zhǎng)所必需的微量元素之一，參與植物光合作用、酶促反應(yīng)和氧化還原等活動(dòng)，在植物生命活動(dòng)中具有不可替代的作用[1]。過(guò)量的錳則抑制植物生長(zhǎng)，甚至通過(guò)食物鏈危害人類健康[2]。我國(guó)因錳礦開(kāi)采等原因造成了大面積的錳污染區(qū)，嚴(yán)重影響人民生產(chǎn)生活。因而，治理錳礦區(qū)污染刻不容緩。植物修復(fù)作為一種成本低、適應(yīng)范圍廣、環(huán)境擾動(dòng)小且治理效果持久的重金屬修復(fù)技術(shù)，是環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。因此，植物修復(fù)技術(shù)是錳污染治理的重要選擇。

植物修復(fù)的前提是篩選出對(duì)重金屬具有耐性，且經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值較高的植物。種子萌發(fā)至幼苗生長(zhǎng)是植物對(duì)環(huán)境脅迫最敏感的時(shí)期，是篩選修復(fù)植物的較好時(shí)期。脅迫環(huán)境下植物的生長(zhǎng)往往會(huì)受到抑制，主要表現(xiàn)為生物量、葉綠素含量下降及積累大量丙二醛(malondialdehyde，MDA)，而抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等的變化是植物對(duì)脅迫的直接反應(yīng)，體現(xiàn)了植物對(duì)脅迫的耐性，是其適應(yīng)脅迫環(huán)境的重要依據(jù)[4]?？寡趸赶到y(tǒng)主要由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)組成，SOD是一種可清除植物體內(nèi)具有強(qiáng)烈毒性超氧陰離子自由基的酶，反應(yīng)產(chǎn)物H2O2可被CAT進(jìn)一步分解或被POD利用。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖在植物適應(yīng)重金屬脅迫中發(fā)揮著重要作用，能夠維持細(xì)胞的含水率和滲透勢(shì)，保護(hù)生物大分子，降低因滲透失水所帶來(lái)的損傷。因此，研究種子萌發(fā)和幼苗生理的變化特征對(duì)污染土壤的修復(fù)具有實(shí)際意義。

黃花草(Cleomeviscosa)為山柑科(Capparaceae)白花菜屬(Cleome)的一種一年生草本植物，在全世界熱帶與亞熱帶均廣泛分布，主要分布在我國(guó)南方各省。該植物生物量大、株型美觀、生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、種子量大，可作為植被恢復(fù)的先鋒物種[5]。通過(guò)在湖南湘潭錳尾礦實(shí)地調(diào)研，發(fā)現(xiàn)該植物是錳礦廢棄地優(yōu)勢(shì)植物之一，在該錳礦廢棄地能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)，是一種值得開(kāi)發(fā)用于錳尾礦植物修復(fù)的材料。目前，對(duì)黃花草的研究較少，主要集中于種子萌發(fā)特性、植被恢復(fù)和藥用價(jià)值等方面[5-6]，關(guān)于錳脅迫下種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及生理特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究根據(jù)不同錳濃度脅迫下黃花草種子的萌發(fā)特性、幼苗生長(zhǎng)和生理特征，探明該植物在錳脅迫下的生理耐受機(jī)制，研究結(jié)果可作為認(rèn)識(shí)植物生長(zhǎng)適應(yīng)錳污染的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為利用黃花草作為錳污染的修復(fù)植物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃花草種子于2016年11月下旬種子成熟時(shí)期采于湖南省湘潭錳礦區(qū)。該礦是我國(guó)開(kāi)發(fā)最早的錳礦之一，礦區(qū)廢棄地污染嚴(yán)重。現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查顯示，該地黃花草長(zhǎng)勢(shì)良好，以草叢形式在多處出現(xiàn)。選擇該地區(qū)長(zhǎng)勢(shì)相同的100株黃花草，采集其種子并置于信封帶回實(shí)驗(yàn)室室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗(yàn) 挑選顆粒飽滿、大小及色澤一致的種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。將種子在0.5%的KMnO4溶液中浸泡30 min，然后用去離子水徹底清洗干凈。根據(jù)趙懷寶等[5]和預(yù)試驗(yàn)的研究結(jié)果，本研究認(rèn)為500 mg·L-1赤霉素(gibberellin，GA)溶液浸種能提高黃花草種子的萌發(fā)率。為檢驗(yàn)赤霉素的效果，一批種子在500 mg·L-1赤霉素溶液中浸泡24 h；作為對(duì)照，另一批種子則在去離子水中浸泡24 h。然后將種子置于直徑為120 mm的培養(yǎng)皿中，其內(nèi)裝200 mL經(jīng)過(guò)清洗滅菌及過(guò)2 mm篩的沙子。參照潘高等[7]的方法，利用MnCl2·4H2O分別設(shè)置0，1000，5000，10000，15000，20000 μmol·L-1(分別記為CK、T1、T2、T3、T4、T5，下同) 6個(gè)錳濃度(組)。每組處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿30粒種子。將培養(yǎng)皿放置在人工氣候培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度為(30±0.5)℃，12 h光照/12 h黑暗，相對(duì)濕度為70%。每天添加去離子水保持培養(yǎng)基質(zhì)濕潤(rùn)。播種后每天定時(shí)觀察并記錄種子萌發(fā)情況，以胚根伸出種皮且長(zhǎng)度達(dá)到種子直徑1/2作為種子萌發(fā)的標(biāo)志。連續(xù)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率直至連續(xù)3 d無(wú)新種子萌發(fā)即認(rèn)為萌發(fā)結(jié)束，在第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第16天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。萌發(fā)結(jié)束后測(cè)定黃花草幼苗的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重、干重，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根冠比。

1.2.2幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)采用盆栽沙培法，盆缽內(nèi)裝200 mL過(guò)2 mm篩的潔凈沙子，置于與萌發(fā)試驗(yàn)相同條件的人工氣候培養(yǎng)箱中。挑選與萌發(fā)試驗(yàn)同一批的黃花草種子進(jìn)行播種，每盆10粒種子。每天添加去離子水保持種子萌發(fā)環(huán)境所需水分，幼苗長(zhǎng)出2至4片真葉時(shí)用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)置與萌發(fā)試驗(yàn)相同的錳濃度處理，每個(gè)處理重復(fù)10次，待長(zhǎng)出6至8片真葉且長(zhǎng)勢(shì)相同時(shí)利用MnCl2·4H2O進(jìn)行錳脅迫[8]。分別在脅迫后的第7、15和30天時(shí)選取黃花草幼苗中、上部位的葉片進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定 黃花草種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定參考黃玉梅等[8]的方法。

發(fā)芽率=16 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)=7 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

活力指數(shù)(VI)=GI×S

式中：Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)；S為幼苗高度。

1.3.2幼苗生物量指標(biāo)測(cè)定 萌發(fā)第16天時(shí)，每個(gè)濃度處理隨機(jī)選取10株幼苗，用精度為0.1 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)定幼苗的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)；用濾紙吸去幼苗表面的水分后稱量鮮重，再于95 ℃下殺青10 min，70 ℃下烘至恒重。

根冠比=根干重/地上部干重

1.3.3生理生化指標(biāo)測(cè)定 采用丙酮浸提法測(cè)定葉綠素含量[9]；采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[9]；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量[9]；采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定游離脯氨酸含量[9]；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量[9]；采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶活性[9]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶活性[9]；采用紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性[9]。各指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3次，每次稱取新鮮黃花草葉片0.3 g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

種子萌發(fā)及幼苗生理各指標(biāo)的數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并利用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對(duì)每個(gè)指標(biāo)不同處理間的差異顯著性進(jìn)行多重比較。最后使用Sigma Plot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳脅迫對(duì)黃花草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

在去離子水浸種的處理下，黃花草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨著錳濃度的增加(表1)，總體呈下降趨勢(shì)。T1處理與對(duì)照相比黃花草種子萌發(fā)各項(xiàng)指標(biāo)差距不大，但T2～T5處理與對(duì)照和T1相比均形成顯著性差異。T2～T5處理使黃花草種子的發(fā)芽率分別降低了38.78%，36.72%，28.56%,30.60%?？梢?jiàn)當(dāng)錳濃度達(dá)到T2處理時(shí)，對(duì)黃花草種子的萌發(fā)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。在500 mg·L-1赤霉素浸種的處理下，黃花草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨著錳濃度的增加，呈現(xiàn)總體下降的趨勢(shì)，且比去離子水浸種處理的下降幅度大。CK(GA)、T1(GA)和T2(GA)處理的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)均顯著高于CK、T1和T2處理，可見(jiàn)赤霉素浸種對(duì)黃花草種子在較低濃度錳處理下的萌發(fā)具有促進(jìn)作用。T5(GA)處理下的黃花草種子發(fā)芽率與T5無(wú)顯著差異，但發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于T5處理，分別降低了41.94%，29.52%，85.79%。可見(jiàn)當(dāng)錳濃度達(dá)到T5處理時(shí)，赤霉素浸種處理對(duì)黃花草種子的萌發(fā)產(chǎn)生了較強(qiáng)的抑制作用。

表1 錳脅迫對(duì)黃花草種子萌發(fā)的影響

注：同列不同大寫字母分別表示不同浸種處理下相同錳處理之間差異顯著，不同小寫字母分別表示相同浸種處理下不同錳處理下之間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different capital letters within the same column show significant differences among the same manganese treatments under different soaking treatments, different lowercase letters within the same column show significant differences among different manganese treatments under the same soaking treatments (P<0.05). The same below.

幼苗生長(zhǎng)是植物對(duì)脅迫響應(yīng)的綜合體現(xiàn)[10]。隨著錳濃度的增加，黃花草幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、生物量和根冠比均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)(表2)，且均在T2處理達(dá)到最大值，在T5處理達(dá)到最低值。說(shuō)明低濃度錳對(duì)黃花草幼苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，高濃度則有抑制作用。

表2 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗葉綠素含量的影響

葉片葉綠素含量是反映植物光合能力的重要指標(biāo)。在錳脅迫7 d時(shí)，黃花草幼苗葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量及葉綠素a/b值隨錳濃度的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(表3)，其中，T2處理顯著提高了葉綠素含量，T3處理葉綠素a/b的值最高，呈現(xiàn)顯著性差異。在處理15 d時(shí)，隨著錳濃度的增加黃花草幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b含量值均呈先下降后升高的變化趨勢(shì)，且在T3處理達(dá)到最低值，T5處理的葉綠素a、葉綠素a+b、葉綠素a/b值均比對(duì)照組要高，且差異達(dá)到顯著水平，表明T3、T4和T5處理對(duì)黃花草葉綠素的合成產(chǎn)生了較大影響。在錳脅迫30 d時(shí)，T1處理下葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量及葉綠素a/b值達(dá)到峰值，分別比對(duì)照增加了43.6%，2.9%，35.1%，38.4%，T5處理葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量降到最低，葉綠素a含量降幅較大。整體上，T1、T2處理可增加黃花草葉綠素含量，T1增加效果最顯著；T5處理會(huì)降低葉綠素含量，可能是因?yàn)楦邼舛儒i抑制了黃花草葉綠素的合成。

表3 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗葉綠素含量的影響

2.3 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗抗氧化酶活性的影響

黃花草幼苗葉片SOD、POD和CAT活性在處理至第7天時(shí)具有明顯的變化趨勢(shì)(圖1)，但隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，3種抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)則無(wú)明顯規(guī)律。黃花草葉片SOD活性在脅迫第7天時(shí)，隨處理濃度的增加呈下降趨勢(shì)；15 d時(shí)，T3、T4處理下SOD活性達(dá)到最高值，T5處理與對(duì)照差異不顯著；30 d時(shí)，只有T4處理下的SOD活性高于對(duì)照，T5比對(duì)照低45.7%。黃花草葉片POD的活性在處理第7天時(shí)隨濃度的增加呈上升趨勢(shì)，處理間差異顯著；15 d時(shí)，T2～T5處理下的POD活性均分別低于第7天時(shí)各處理活性；在30 d時(shí)，T2處理達(dá)到該處理最大值，T4、T5處理繼續(xù)下降。隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，T1處理的CAT活性逐漸升高；T2～T5處理下黃花草葉片CAT活性呈先下降后升高的變化趨勢(shì)，T2～T4處理的最高值則出現(xiàn)在第30天，T5處理的最高值出現(xiàn)在第7天。結(jié)果表明，黃花草幼苗3種抗氧化酶活性在錳脅迫初期較高，可緩解高濃度錳脅迫造成的傷害，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SOD和POD的活性出現(xiàn)不同程度的下降，而CAT的活性有所提高，說(shuō)明高濃度錳脅迫后期黃花草的抗氧化能力衰退，CAT起清除活性氧的關(guān)鍵作用。

2.4 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響

隨處理濃度的增加，黃花草葉片中脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量在第7、15天呈上升的趨勢(shì)(圖2)。處理第30天時(shí)，黃花草葉片中脯氨酸、可溶性糖含量隨錳濃度的增加呈下降趨勢(shì)，且相較第15天，可溶性糖含量的總體下降幅度大于脯氨酸，表明可溶性糖對(duì)錳脅迫更加敏感?？扇苄缘鞍缀吭谔幚淼?0天依然呈隨濃度增加而上升的趨勢(shì)，但T3～T5處理明顯降低了其含量。綜上所述，黃花草幼苗在高濃度錳脅迫的前、中期可通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)緩解毒害，但隨脅迫時(shí)間的增加，這一機(jī)制就會(huì)受到破壞，主要表現(xiàn)在T3～T5處理。

2.5 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗MDA含量的影響

植物器官衰老或在逆境下遭受脅迫時(shí)往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低可反映植物細(xì)胞遭受逆境脅迫的程度。隨著錳濃度的增加，黃花草幼苗的MDA含量與對(duì)照相比呈先下降后升高的變化趨勢(shì)；隨著脅迫時(shí)間增加，高錳濃度處理下MDA含量均顯著升高(圖3)。T1處理下黃花草葉片MDA含量均低于對(duì)照組，但差異不顯著；T2～T5處理MDA含量隨錳濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)上升幅度增大。在7、15和30 d時(shí)，T5處理下葉片MDA含量分別是對(duì)照組的3.1、3.5、3.6倍。綜上表明，T1處理并不會(huì)脅迫損傷黃花草幼苗，T2處理會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸表現(xiàn)出較小的脅迫效果，T3、T4、T5處理對(duì)黃花草幼苗表現(xiàn)出的脅迫效應(yīng)會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而加大。

圖3 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗MDA含量的影響

3 討論

3.1 錳脅迫對(duì)黃花草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)是植物對(duì)外界環(huán)境變化最敏感的階段，也是植物生活史中最脆弱的時(shí)期，能夠反映植物的適應(yīng)能力[11]。植物能否在錳污染土壤上生存取決于其種子及幼苗在錳脅迫下是否可以萌發(fā)、生長(zhǎng)，幼苗生長(zhǎng)狀況直接影響植株以后的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究中，黃花草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨錳濃度的增加而下降，說(shuō)明錳脅迫對(duì)黃花草種子的萌發(fā)有抑制作用。這與文珂等[10]對(duì)錳脅迫下野大豆(Glycinesoja)以及徐雅梅等[12]對(duì)錳、鉛脅迫下垂穗披堿草(Elymusnutans)的研究結(jié)果一致。這表明錳脅迫對(duì)植物種子萌發(fā)有抑制作用是一種常見(jiàn)現(xiàn)象，原因可能是錳脅迫環(huán)境下種子內(nèi)部?jī)?chǔ)存物質(zhì)的分解及轉(zhuǎn)化受到抑制，進(jìn)而影響種子萌發(fā)。

黃花草種子存在休眠現(xiàn)象，本研究前期試驗(yàn)顯示采集種子后放置6個(gè)月，未見(jiàn)種子萌發(fā)。本研究是將該植物種子于室溫下放置一年后開(kāi)展萌發(fā)試驗(yàn)，但發(fā)芽率仍較低(50%左右)。采用500 mg·L-1赤霉素浸種處理后黃花草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在0～5000 μmol·L-1錳處理時(shí)均顯著高于去離子水浸種處理，最高可達(dá)74.44%，說(shuō)明赤霉素浸種對(duì)黃花草種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用。當(dāng)錳濃度達(dá)到15000～20000 μmol·L-1時(shí)，發(fā)芽率則無(wú)明顯差異，說(shuō)明赤霉素浸種對(duì)高濃度錳處理下種子的萌發(fā)無(wú)促進(jìn)作用。這與陳志飛等[13]對(duì)干旱脅迫下赤霉素對(duì)高羊茅(Festucaelata)種子萌發(fā)以及牛宋芳等[14]對(duì)鹽脅迫下赤霉素對(duì)紅砂(Reaumuriasoongorica)種子萌發(fā)的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明脅迫條件下赤霉素處理效果具有交互作用。其原因可能是赤霉素在高脅迫條件下加速了種子的新陳代謝活動(dòng)，卻產(chǎn)生了較多的廢物，導(dǎo)致種子發(fā)芽情況未能顯著提高。這需要有更多的研究來(lái)驗(yàn)證這一結(jié)果。

本研究顯示，在1000～5000 μmol·L-1錳處理下黃花草幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、干重和根冠比均高于對(duì)照且差異顯著；當(dāng)錳濃度達(dá)到20000 μmol·L-1時(shí)，幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、干重和根冠比則均顯著低于對(duì)照，表明高濃度錳處理會(huì)對(duì)黃花草幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制作用，這種低促高抑的現(xiàn)象與王佳等[15]對(duì)錳脅迫下美洲商陸(Phytolaccaamericana)幼苗生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致。本研究顯示隨著錳濃度的增加，黃花草幼苗根受到的抑制作用比芽大，這與多數(shù)研究結(jié)果一致[7-16]。原因可能是因?yàn)楦钕冉佑|錳，且是植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的主要器官，導(dǎo)致受到的抑制程度大于芽。

3.2 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量是衡量植物光合作用強(qiáng)弱的重要生理參數(shù)，間接體現(xiàn)植物對(duì)脅迫的適應(yīng)能力[17]。在本研究中，低濃度(1000～5000 μmol·L-1)錳處理下黃花草幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和葉綠素a/b均比對(duì)照組有所增加，而隨著錳濃度的增加，這些指標(biāo)則逐漸下降并在較高濃度低于對(duì)照組。這與侯明等[18]對(duì)釩、鉻單一和復(fù)合脅迫下小麥(Triticumaestivum)幼苗葉片葉綠素含量及張?chǎng)├虻萚19]對(duì)枸杞(Lyciumbarbarum)葉片在混合鹽脅迫下葉綠素含量的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明低濃度錳處理會(huì)促進(jìn)葉綠素的合成，更有利于光合作用；而在錳處理濃度超出植物耐受范圍時(shí)，葉綠體受到損傷，葉綠素分解速度加快，光合能力減弱。其可能原因是錳既是組成葉綠體的必要元素，又直接參與光合放氧過(guò)程，所以低濃度錳處理下葉綠素含量增加，而高濃度錳處理下植物體內(nèi)錳含量過(guò)高，受到毒害，抑制了葉綠體正常結(jié)構(gòu)的合成及相關(guān)酶活性，葉綠素含量降低[1]。

此外，本研究還顯示，在脅迫第7天時(shí)，葉綠素a+b最大含量和葉綠素a/b最大值分別出現(xiàn)在5000 μmol·L-1處理和10000 μmol·L-1處理，脅迫至第30天時(shí)，則均出現(xiàn)在1000 μmol·L-1處理。這與燕江偉等[20]對(duì)干旱與鎘復(fù)合脅迫下互葉醉魚(yú)草(Buddlejaalternifolia)幼苗葉綠素含量的研究結(jié)果一致。一般認(rèn)為植物葉綠素a/b的值越大，類囊體堆疊的程度越大，光能利用率越高[21]。隨著錳脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，1000 μmol·L-1錳處理下的黃花草幼苗能保持葉綠素a+b含量和葉綠素a/b值高于對(duì)照，這說(shuō)明該濃度處理能夠促進(jìn)黃花草幼苗葉綠素的合成，維持自身正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.3 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗抗氧化酶活性的影響

一般情況下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。而當(dāng)植物處于逆境中時(shí)，植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧自由基，造成膜脂過(guò)氧化，降低酶活及細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力，對(duì)植物產(chǎn)生毒害。植物的抗氧化酶系統(tǒng)主要由SOD、POD和CAT協(xié)同構(gòu)成，起著清除活性氧、降低脅迫所造成毒害的重要作用。本研究中，黃花草幼苗葉片中SOD活性在脅迫第7天隨錳脅迫濃度的增加而下降，但在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)屬于較高水平；隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性有所下降，20000 μmol·L-1處理下降最顯著。這與段才緒等[22]對(duì)鹽脅迫下決明(Cassiaobtusifolia)的研究結(jié)果一致。說(shuō)明高濃度長(zhǎng)時(shí)間的錳脅迫會(huì)降低SOD活性。在脅迫第7天，黃花草幼苗葉片POD和CAT呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，活性均隨錳濃度增加而快速增加，但隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度處理下的POD活性會(huì)下降，而CAT的活性變化不明顯。辛建攀等[23]研究表明隨著鎘濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，梭魚(yú)草(Pontederiacordata)葉片SOD和POD活性下降明顯，CAT活性無(wú)明顯變化。這與本研究結(jié)果一致。說(shuō)明隨著錳濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生已大于清除能力，加劇了植物細(xì)胞功能膜及酶系統(tǒng)的損傷。綜上，黃花草通過(guò)SOD、POD和CAT協(xié)同作用緩解氧化損傷，可忍受較高濃度錳脅迫。

3.4 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響

植物在遭受各種逆境脅迫時(shí)，會(huì)迅速產(chǎn)生并積累脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以保持細(xì)胞正常含水率及膨壓，對(duì)抗外界的不利環(huán)境[24]。脯氨酸是植物體內(nèi)最常見(jiàn)且有效的小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；可溶性糖在參與滲透調(diào)節(jié)的同時(shí)可為植物生長(zhǎng)和對(duì)抗不利環(huán)境因素提供能量；可溶性蛋白不僅參與植物體內(nèi)大部分的代謝活動(dòng)，還具有較強(qiáng)的親水性，可緩解因滲透脅迫所造成的細(xì)胞失水[7-8]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，含量越多表示抗性越強(qiáng)。但當(dāng)脅迫超過(guò)植物的耐受范圍時(shí)，則會(huì)破壞這一機(jī)制，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成受到阻礙，含量減少[25]。本研究中，黃花草幼苗葉片中脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量在脅迫第7、15天均快速積累增加，至第30天時(shí)急劇下降，濃度高的下降更為明顯。這與張虎等[26]對(duì)鈷脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)的研究結(jié)果一致。說(shuō)明黃花草幼苗通過(guò)提高脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量緩解較高濃度錳脅迫帶來(lái)的毒害，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量減少，平衡機(jī)制受到破壞，抗逆性降低。

3.5 錳脅迫對(duì)黃花草幼苗MDA含量的影響

逆境條件下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，使細(xì)胞膜脂發(fā)生過(guò)氧化，細(xì)胞膜通透性增大。MDA作為細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量高低代表植物遭受毒害的強(qiáng)度和對(duì)逆境條件下的反應(yīng)能力。在本研究中，隨著錳濃度的增加，黃花草幼苗葉片MDA呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，僅1000 μmol·L-1處理下的MDA含量低于對(duì)照組，說(shuō)明該濃度處理不會(huì)對(duì)黃花草幼苗產(chǎn)生脅迫作用，與本研究中關(guān)于葉綠素含量的結(jié)果一致。高濃度錳處理下黃花草幼苗葉片MDA含量會(huì)隨濃度增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，這與汪結(jié)明等[27]對(duì)4種藤本植物在錳污染土壤中的生理響應(yīng)研究結(jié)果一致。說(shuō)明高濃度錳脅迫導(dǎo)致黃花草幼苗細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，植株所受毒害程度加大。

4 結(jié)論

錳脅迫會(huì)降低黃花草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。赤霉素浸種處理可增加黃花草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。隨著錳濃度的增加，黃花草幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、生物量和根冠比呈現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象。黃花草可通過(guò)提高SOD、POD和CAT活性及積累脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量來(lái)緩解錳脅迫所造成的毒害。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)1000 μmol·L-1錳處理能夠促進(jìn)黃花草的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為葉綠素含量的增加。但當(dāng)錳濃度高于15000 μmol·L-1時(shí)，黃花草葉片MDA含量急劇增加，且抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量降低，說(shuō)明黃花草生長(zhǎng)受到抑制，且隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用更加明顯。