吉訓(xùn)志 秦曉威 胡麗松 王曉陽 李付鵬 郝朝運(yùn)

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所/農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬寧 571533)

植物組織培養(yǎng)技術(shù)起初來源于1905年德國植物學(xué)家Haberlandt提出的植物細(xì)胞具有全能性的概念，即指植物的每個(gè)細(xì)胞都具有母體的全套遺傳信息，擁有能夠發(fā)育成完整植株的能力，在適宜的條件下，任一細(xì)胞都能發(fā)育成新個(gè)體，植物細(xì)胞全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)[1-2]。自Steward等[3]和Reinert[4]利用胡蘿卜離體根細(xì)胞，經(jīng)過組織培養(yǎng)下發(fā)育成體細(xì)胞胚，進(jìn)而發(fā)育成完整植株以來，植物離體再生技術(shù)就不斷受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。植物離體再生的一般過程主要是離體的植物組織，在適宜的培養(yǎng)條件下，通過脫分化形成愈傷組織，愈傷組織進(jìn)一步發(fā)育成體細(xì)胞胚，然后體細(xì)胞胚經(jīng)歷類似合子胚的發(fā)育過程，最終再生成完整植株。近年來，在許多木本植物上都已成功進(jìn)行了植物組織培養(yǎng)研究， 如桃樹[5]、 蘋果[6]、 梨樹[7]、 荔枝[8]等植物的離體再生技術(shù)的研究上都取得了重要的研究成果。雖有一些木本植物已成功建立離體再生體系，但仍有不少木本植物的組織培養(yǎng)研究與組培苗進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化上存在著問題。因此，有必要對(duì)木本植物組織培養(yǎng)中的再生方式、關(guān)鍵因素與突出問題等方面研究進(jìn)行概括與分析，這將有利于木本植物組織研究進(jìn)一步開展，并提供理論參考。

1 木本植物組織培養(yǎng)中再生方式

1.1 器官發(fā)生

植物器官發(fā)生是指離體的植物組織，如莖段、莖尖與頂芽等部位，不經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷組織的去分化過程，直接誘導(dǎo)叢生芽與不定根，再生成完整植株的過程。植物的外植體來源及其所處的發(fā)育階段，與不同部分的極性都是影響器官發(fā)生的主要因素。并且器官發(fā)生對(duì)于培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例有著很高的要求，不同的比例常常確定器官發(fā)生的方向，這在本文的激素部分已進(jìn)行了論述。而光照、溫度等誘導(dǎo)條件對(duì)于植物器官發(fā)生也起著重要調(diào)控作用，不定芽的生長(zhǎng)分化通常需要充足的光照條件，且充足的光照可避免玻璃化苗的出現(xiàn)。

1.2 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)

體細(xì)胞胚誘導(dǎo)是指在植物組織培養(yǎng)中，以植物組織、器官或原生質(zhì)體等為外植體，經(jīng)過特定的培養(yǎng)條件，組織細(xì)胞脫分化形成快速生長(zhǎng)分裂的細(xì)胞團(tuán)，即愈傷組織。然后愈傷組織進(jìn)一步生長(zhǎng)分化，再分化成具有與合子胚一樣能夠發(fā)育成完整植株的無性胚狀體結(jié)構(gòu)，稱為體細(xì)胞胚。

在木本植物組織培養(yǎng)的研究中，大多數(shù)的木本植物都是需要通過體細(xì)胞胚誘導(dǎo)來完成植株的再生。況且誘導(dǎo)體細(xì)胞胚能夠極大地發(fā)揮植物細(xì)胞的再生分化潛力，在荔枝[9]、龍眼[10]與蘋果[11]等果樹的組織培養(yǎng)中，通過大量增殖愈傷組織，能夠誘導(dǎo)獲得大量體細(xì)胞胚，每個(gè)體細(xì)胞胚都具有發(fā)育成完整植株的潛力，并且可以將這些體細(xì)胞胚制作成人工種子，做到對(duì)優(yōu)良種苗資源的高效繁育，蘊(yùn)含著極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但大量木本植物的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)困難與誘導(dǎo)體細(xì)胞胚不正常的問題，這是制約木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的瓶頸。

體細(xì)胞胚誘導(dǎo)除了與上述外植體、植物激素、培養(yǎng)條件等有著密切的關(guān)系，植物的基因型也是一個(gè)重要的影響因素。在一種植物的不同品種中，各個(gè)品種的體細(xì)胞胚發(fā)生能力不同[12]。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)很大程度上取決于愈傷組織的胚性，胚性強(qiáng)的愈傷組織能夠自發(fā)地分化成高質(zhì)量的體細(xì)胞胚。因此，選用分生能力旺盛的外植體，在適宜的培養(yǎng)條件與激素條件下，獲得并保持高胚性的愈傷組織，是體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的關(guān)鍵。并且體細(xì)胞胚誘導(dǎo)在基因轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展方面，能夠提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.3 體細(xì)胞胚再生

體細(xì)胞胚再生是指體細(xì)胞胚經(jīng)歷類似合子胚發(fā)育過程，進(jìn)一步發(fā)育成完整植株的階段。這是植物組織培養(yǎng)技術(shù)中最關(guān)鍵的一步，之前對(duì)所有因素的探索，都是為了能夠獲得再生植株。在體細(xì)胞胚再生過程中，大多數(shù)學(xué)者會(huì)將培養(yǎng)基中的基本元素與營養(yǎng)物質(zhì)減半，或不添加任何的植物激素，以充分發(fā)揮體細(xì)胞胚自身的分化能力[13]。因此，獲得高質(zhì)量的體細(xì)胞胚是植株再生成功很重要的關(guān)鍵。

從外植體誘導(dǎo)獲得愈傷組織，愈傷組織再進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生，最后體細(xì)胞胚經(jīng)過生長(zhǎng)萌發(fā)成擁有根、莖、葉的完整植株，此過程都是在無菌培養(yǎng)條件下進(jìn)行的異養(yǎng)培養(yǎng)。而再生植株最終是需要進(jìn)行移栽，自我生長(zhǎng)成正常的種苗。從異養(yǎng)到自養(yǎng)的過程中，再生植株需要經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)階段，不同植物品種的適應(yīng)能力不同，導(dǎo)致移栽成活的難易程度不一。

1.4 再生植株移栽

再生植株的根系、葉片與莖段等植物器官對(duì)于移栽成功十分重要。開瓶煉苗是植株移栽過程中的過渡階段，目的在于讓再生苗預(yù)先適應(yīng)外部環(huán)境，光照強(qiáng)度不宜過強(qiáng)，以保護(hù)新生的葉片，且避免過強(qiáng)的蒸騰作用，造成葉片萎蔫，使再生苗脫水死亡[14]。而根系中的側(cè)根是植株能夠從土壤中吸取養(yǎng)分的最重要組織器官，因此誘導(dǎo)再生植株長(zhǎng)出側(cè)根發(fā)達(dá)的根系對(duì)于移栽成活至關(guān)重要。

2 木本植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因素

2.1 基本培養(yǎng)基

在對(duì)植物進(jìn)行組織培養(yǎng)研究時(shí)，首先需考慮培養(yǎng)基選擇的問題，而基本培養(yǎng)基的選擇是在研究中優(yōu)先被考慮?，F(xiàn)今，依照基本培養(yǎng)基的成分與元素的濃度，大致分為4個(gè)類型：富集元素平衡培養(yǎng)基(包括 MS、LS、BL、ER等)， 高硝酸鉀含量培養(yǎng)基(包括 B5、N6、SH等)，中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基(包括 H、Nitsch、Miller等)和低無機(jī)鹽培養(yǎng)基(包括White、WS、HE等)[15]。在絕大多數(shù)的植物組織培養(yǎng)中，通常選擇MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，但也需要參照目標(biāo)植物的近緣物種的相關(guān)研究成果進(jìn)行選擇基本培養(yǎng)基。不過，在一般情況下，植物能夠適應(yīng)多種基本培養(yǎng)基，但不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)目的，選擇最佳的基本培養(yǎng)基不同。

趙雪惠等[16]在對(duì)麻瘋樹的組織培養(yǎng)研究中，以幼胚為外植體，去除胚乳，接種MS、LM、WPM、N6 4種未添加任何植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)N6早生出胚根，而MS與WPM能夠大量誘導(dǎo)出愈傷組織，并且WPM培養(yǎng)基上的分化不定芽數(shù)量最多，在不定芽生根中，以LM與WPM培養(yǎng)基的生根誘導(dǎo)率最高，不過WPM培養(yǎng)基上的主根較少，側(cè)根系發(fā)達(dá)，因此WPM培養(yǎng)基是最佳培養(yǎng)基。雖然基本培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)中起到支撐作用，但各種培養(yǎng)基都包含了植物生長(zhǎng)所需的基本元素，只是其濃度比例不一，并且在實(shí)際培養(yǎng)中仍需添加激素、抗氧化劑或一些物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充，使得培養(yǎng)效果達(dá)到最佳。

2.2 植物激素

在1905年德國植物學(xué)家Haberlandt提出植物細(xì)胞具有全能性的概念時(shí)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)就已經(jīng)開始發(fā)展，不過其技術(shù)發(fā)展歷程十分艱辛與緩慢，很大的原因是當(dāng)時(shí)尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)植物細(xì)胞生長(zhǎng)分化起著促進(jìn)作用，但其濃度很低的物質(zhì)，后來這類物質(zhì)被稱為植物激素。目前，天然植物激素因其主要的調(diào)控作用，被分為5類：生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、乙烯和脫落酸[17]。由于天然植物激素在植物體內(nèi)含量極微，因此想從天然來源提取激素十分困難且不經(jīng)濟(jì)。在了解天然植物激素化學(xué)結(jié)構(gòu)后，現(xiàn)如今已經(jīng)可以大量人工合成植物激素，并對(duì)原有結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，制成活性更強(qiáng)的植物激素類似物，如常用的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)與KT(激動(dòng)素)等物質(zhì)。自植物激素運(yùn)用以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品種植物的離體再生，獲得完整植株。

2.2.1 生長(zhǎng)素

生長(zhǎng)素是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物內(nèi)源激素，參與了植物根和莖的發(fā)育、器官的衰老與維管束組織的形成等方面的植物生長(zhǎng)分化過程。在植物組織培養(yǎng)研究中，常用的生長(zhǎng)素主要包括IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA、2，4-D，其中以2，4-D的活性最強(qiáng)，濃度過高，易引起遺傳變異。并且過高的生長(zhǎng)素濃度會(huì)對(duì)木本植物誘導(dǎo)芽增殖起到抑制作用[18]。

王慧梅等[19]在對(duì)不同生長(zhǎng)素影響喜樹組培苗生根的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA比NAA對(duì)誘導(dǎo)生根效果要好，但兩者濃度過高都會(huì)對(duì)生根造成抑制效果，最佳的濃度為IBA 0.5 mg/L。而在對(duì)紅松的組織培養(yǎng)研究中，也獲得了相似的結(jié)果，在生長(zhǎng)素類激素含量較高時(shí)發(fā)生不定根[20]。何業(yè)華等[21]在對(duì)棗樹愈傷組織形成的不定芽進(jìn)行不定根誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA效果最好 ,其次是 IAA,NAA生根率低，并且仍會(huì)有大量愈傷組織生成，而2，4-D主要以愈傷組織誘導(dǎo)為主。

2.2.2 細(xì)胞分裂素

細(xì)胞分裂素是在組織培養(yǎng)中另一種重要的植物內(nèi)源激素，通常與生長(zhǎng)素一起使用，兩者相輔相成，能夠達(dá)到更好的培養(yǎng)效果。細(xì)胞分裂素大致可分成兩類,一類是嘌呤型細(xì)胞分裂素(CTK),另一類是苯基脲型細(xì)胞分裂素(PUD)。植物組織培養(yǎng)中常用的第一類嘌呤型細(xì)胞分裂素，包括BA(芐基腺嘌呤,又稱 6-BA,BAP)，KT(激動(dòng)素,KIT,KIN)，2IP(2-異戊烯基腺嘌呤)，ZEA(玉米素,即異戊二烯腺嘌呤,又稱ZT)。苯基脲型細(xì)胞分裂素是新型的細(xì)胞分裂素，其中TDZ(噻苯隆)是人工合成的一種植物激素，因具有高度的細(xì)胞分裂素活性，也常被使用。在對(duì)紅松和棗樹的組織培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素BA對(duì)誘導(dǎo)不定芽的效果較好，不過BA會(huì)抑制不定根的產(chǎn)生。楊振國等[22]在防止酸櫻桃組培苗玻璃化的研究中，發(fā)現(xiàn)BA會(huì)提高玻璃化率，而KT對(duì)玻璃化無影響。Huetteman等[23]在探討TDZ對(duì)于木本植物組織培養(yǎng)中的影響認(rèn)為，TDZ能夠促進(jìn)許多再生困難的木本植物品種完成微繁殖過程，在濃度低于1 μmol/L時(shí)，能夠使腋芽增殖，但可能抑制芽的伸長(zhǎng)；在濃度高于1 μmol/L時(shí)，能夠刺激愈傷組織的形成、誘導(dǎo)叢生芽與體細(xì)胞胚發(fā)生。

2.2.3 赤霉素

赤霉素至今已發(fā)現(xiàn)100多種，總稱為赤霉素類(GAs)。其中只有少數(shù)赤霉素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有生物活性，在木本組織培養(yǎng)的研究中應(yīng)用較多的是GA3。GA3的作用類似于生長(zhǎng)素，但與其不同的是，GA3對(duì)完整植株的作用要強(qiáng)于對(duì)離體器官或組織的作用。GA3可刺激器官的生長(zhǎng)，卻抑制器官的發(fā)生，如GA3對(duì)不定根的產(chǎn)生具有抑制作用，但在根原基形成以后，則不對(duì)不定根的發(fā)生造成影響[24]。

鄭啟發(fā)等[25]在對(duì)龍眼和荔枝的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3對(duì)兩者的愈傷組織誘導(dǎo)具有抑制作用，應(yīng)該省去不用。林妃等[26]在對(duì)白木香組織培養(yǎng)技術(shù)及植株再生的研究中發(fā)現(xiàn)，GA3僅對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，其余誘導(dǎo)器官發(fā)生的部分都不宜使用。而在宿靜等[27]對(duì)于美國月桂櫻組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3對(duì)芽的伸長(zhǎng)沒有效果。據(jù)相關(guān)報(bào)道，赤霉素能促進(jìn)植物開花，但對(duì)于植物離體再生作用較小，尚沒有廣泛運(yùn)用。

2.2.4 乙烯

乙烯是一種氣態(tài)的植物激素，廣泛存在于植物成熟的果實(shí)果皮中，對(duì)催化果實(shí)成熟有促進(jìn)作用。而乙烯對(duì)于植物組織培養(yǎng)作用方面的研究尚少。Kumar[28]和Biddington[29]都對(duì)乙烯在愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生、不定芽與不定根的誘導(dǎo)等相關(guān)研究進(jìn)行了概述，表明了乙烯在不同植物品種中具有起到的作用不一，而在木本組織培養(yǎng)中，乙烯的作用很少涉及。謝耀堅(jiān)[30]在對(duì)歐洲云杉胚性愈傷組織培養(yǎng)中乙烯的釋放及其作用的研究中，發(fā)現(xiàn)乙烯釋放量的變化對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率無明顯促進(jìn)或抑制作用。乙烯在木本植物組織培養(yǎng)方面的作用仍需進(jìn)一步研究。

2.2.5 脫落酸

脫落酸作為五大類激素之一，對(duì)植物細(xì)胞分裂擴(kuò)增起著重要調(diào)控作用，而且經(jīng)常在組織培養(yǎng)方面，通過提高愈傷組織的干燥耐受性和防止提早發(fā)芽，從而促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)生與提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量。脫落酸不只調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，還在植物細(xì)胞受到脅迫時(shí)發(fā)揮作用。因此，脫落酸以其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中所起的獨(dú)特作用，近年來不斷受到科學(xué)家的青睞，研究深度與廣度逐步增加。

Bawis等[31]進(jìn)行了脫落酸對(duì)棕櫚樹體細(xì)胞胚發(fā)生的影響研究，發(fā)現(xiàn)添加0.1 mg/L脫落酸時(shí)，促進(jìn)的體細(xì)胞胚發(fā)生量最大，濃度過高則會(huì)減少體細(xì)胞胚的發(fā)生量。Alwael等[32]同樣以棕櫚樹為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用懸浮培養(yǎng)方式，與添加50～100μmol/L的脫落酸濃度對(duì)同步化誘導(dǎo)體細(xì)胞胚具有促進(jìn)作用。Fernando等[33]在利用未成熟的椰子種子為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)后，以添加7.5 μmol/L的脫落酸濃度，體細(xì)胞胚發(fā)生量最大，但無法進(jìn)一步萌發(fā)出芽，而2.5～5 μmol/L的ABA濃度，可以成功生出芽。

2.3 碳源

在對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，除了需要添加植物激素，與基本培養(yǎng)基所提供的基本營養(yǎng)元素外，生長(zhǎng)發(fā)育主要所需的能量物質(zhì)是由碳源物質(zhì)所提供的。碳源一般是糖類物質(zhì)，常用的碳源物質(zhì)有蔗糖、葡萄糖、果糖與半乳糖等。其中蔗糖與果糖，在植物組織培養(yǎng)中最為廣泛運(yùn)用。碳源不只是為植物細(xì)胞提供能量物質(zhì)，還能為植物細(xì)胞提供滲透壓，提供細(xì)胞吸取養(yǎng)分的動(dòng)力，而滲透壓與碳源的種類與濃度密切相關(guān)。

蔗糖是植物組織培養(yǎng)中，最常用的碳源物質(zhì)，屬于非還原性二糖。蔗糖在供能外，還能促進(jìn)愈傷組織的再分化。由于植物細(xì)胞對(duì)蔗糖的吸收速率較慢，因此蔗糖能夠長(zhǎng)期保持較穩(wěn)定的滲透壓，為植物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境。而且蔗糖一般不能被微生物直接利用，對(duì)微生物的污染有一定程度的減輕效果。

張小蘋[34]利用不同碳源對(duì)桑樹莖尖進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)果糖是桑樹誘導(dǎo)芽尖與繼代培養(yǎng)效果最佳的碳源，而葡萄糖可在繼代培養(yǎng)中替代果糖，達(dá)到更好的培養(yǎng)效果。謝志兵[35]利用不同碳源對(duì)獼猴桃的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖和葡萄糖對(duì)芽的分化效應(yīng)無明顯差異，不過低濃度的碳源不能很好地進(jìn)行芽分化和生長(zhǎng)，而高濃度的碳源雖能較好地誘導(dǎo)芽分化，但抑制了后期芽的生長(zhǎng)。在植物組織培養(yǎng)中，一般多用蔗糖作為培養(yǎng)基碳源，對(duì)于個(gè)別植物的組織培養(yǎng)則以葡萄糖與果糖這些單糖作為碳源更佳。因此，對(duì)植物組織培養(yǎng)中碳源種類與濃度的選擇也是必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.4 pH值

pH值在植物組織培養(yǎng)研究中，通常代表著培養(yǎng)基中的酸堿度。大多數(shù)植物在離體培養(yǎng)中，pH值的要求5.0～6.2。適宜的pH值，是植物組織離體再生過程中能夠正常吸取生長(zhǎng)養(yǎng)分的重要影響因素。并且pH值能夠影響培養(yǎng)基的凝固程度，當(dāng)pH較低(≤4.0)時(shí)，加入一定量的凝固劑，培養(yǎng)基都難于凝固。而培養(yǎng)基的凝固程度對(duì)培養(yǎng)物的支撐作用，對(duì)其保證正常生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

周再知等[36]在鈣離子與pH值對(duì)柚木組培苗生長(zhǎng)和礦質(zhì)養(yǎng)分吸收影響的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值對(duì)苗高生長(zhǎng)及愈傷組織生物量積累有顯著影響，適宜pH值為6.0，只有穩(wěn)定在最適pH值上，增加鈣離子濃度，才會(huì)增加柚木組培苗的營養(yǎng)元素吸收。李欣怡等[37]對(duì)3個(gè)越橘品種組培苗在pH值5～9條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同越橘品種在相同pH值條件下生長(zhǎng)狀況不一致。因此，表明pH值是影響植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，而且不同植物品種的最適pH值都有所不同。

3 影響木本植物組織培養(yǎng)的突出問題

3.1 外植體滅菌

外植體消毒滅菌，是植物組織培養(yǎng)技術(shù)中關(guān)鍵的一步。不僅要求對(duì)外植體進(jìn)行徹底滅菌，還要盡可能地減少對(duì)外植體細(xì)胞的傷害，保證植物細(xì)胞仍具有旺盛的生長(zhǎng)分化能力[38]。在植物生長(zhǎng)過程中，如頂芽、莖和葉等許多植物組織，常年暴露在外界環(huán)境中，容易附生或共生多種微生物，并且微生物可侵入組織內(nèi)部，致使外植體消毒滅菌困難，易造成內(nèi)生菌污染。由于熱帶、亞熱帶地區(qū)常年高溫多雨，空氣濕度大，使得內(nèi)生菌污染現(xiàn)象更為嚴(yán)重。因此，選取含菌較少且生長(zhǎng)分化能力較強(qiáng)的植物組織作為外植體，在適宜的滅菌方法下進(jìn)行外植體消毒滅菌，是建立植物無菌培養(yǎng)離體再生的關(guān)鍵。

方慶等[39]對(duì)桃的莖段進(jìn)行升汞、次氯酸鈉和乙醇3種滅菌方法發(fā)現(xiàn)，以乙醇加0.2%升汞滅菌9 min的組合效果最佳；馬蘭珍等[40]對(duì)不同來源的雜交松外植體采用不同的滅菌方法進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境下的外植體帶菌程度不同，來自于林學(xué)院苗圃的外植體在75%酒精與0.1%升汞5～6 min滅菌下效果較好，而來自于東門林場(chǎng)苗圃及林業(yè)局種苗基地的外植體以上方法都不理想，可能與其周圍環(huán)境的微生物較多有關(guān)；岑湘濤等[41]在對(duì)杧果莖段離體培養(yǎng)中外植體選擇與滅菌方法進(jìn)行了探索發(fā)現(xiàn)，以室內(nèi)沙培杧果帶腋芽的莖段在乙醇消毒30s后0.1%升汞滅菌8 min的腋芽萌發(fā)率較高。

前人對(duì)外植體滅菌大部分采用表面滅菌，常用的滅菌劑有乙醇、次氯酸鈉、升汞與高錳酸鉀等，通常需要將不同滅菌劑進(jìn)行組合使用，以求達(dá)到最佳的滅菌效果。同時(shí)要嚴(yán)格控制滅菌時(shí)間，如升汞在滅菌過程中，時(shí)間過短，殺菌不徹底，易導(dǎo)致外植體污染嚴(yán)重，而時(shí)間過長(zhǎng)，則會(huì)對(duì)組織細(xì)胞起到殺傷作用，最終使外植體死亡。因此，應(yīng)盡量選擇含菌較少，生長(zhǎng)能力強(qiáng)的植物組織作為外植體。

3.2 外植體褐化

外植體褐化有兩種形式：一種是酶促褐化，指在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體材料由于自身多酚氧化酶作用，將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，并向培養(yǎng)基中釋放，致使培養(yǎng)基變褐，影響外植體細(xì)胞的正常生命代謝活動(dòng)，毒害整個(gè)外植體組織，最終逐漸死亡；另一種是非酶促褐化，常是由于外植體自身細(xì)胞受外界環(huán)境不利因素影響，造成的細(xì)胞壞死，或發(fā)生細(xì)胞程序性死亡的褐化現(xiàn)象。

王玖瑞等[42]在利用棗幼胚建立離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，外植體褐化是棗幼胚離體培養(yǎng)的關(guān)鍵問題，而剝?nèi)ヅ咧橹械闹楸缓笤龠M(jìn)行接種，可有效防止外植體褐化。鄔秀宏等[43]在對(duì)茶樹組織培養(yǎng)的外植體褐化現(xiàn)象控制方面進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，外植體表面消毒以6 min為宜，并且Vc和核黃素對(duì)防止茶樹外植體褐化均有良好效果。付鳳玲等[44]在對(duì)桑樹莖尖培養(yǎng)的外植體褐化的控制研究中發(fā)現(xiàn)，活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、Na2S2O3以及用 8-羥基喹啉等抗氧化劑對(duì)外植體褐化具有很好的控制作用，不過活性炭對(duì)莖葉生長(zhǎng)有抑制作用，而聚乙烯吡咯烷酮副作用較小，是理想的抗氧化劑，能添加到培養(yǎng)基和對(duì)外植體進(jìn)行前處理。張小紅等[45]在對(duì)核桃離體培養(yǎng)外植體褐化的研究中發(fā)現(xiàn)，幼嫩的外植體比半木質(zhì)化與休眠期的外植體更容易發(fā)生褐化，液體培養(yǎng)能夠減輕褐化，植物激素6-BA、IAA與GA也能夠減輕外植體的褐化程度，硫代硫酸鈉對(duì)外植體防褐化、提高外植體萌芽率與有效新梢率有促進(jìn)作用。

3.3 愈傷組織褐化

愈傷組織褐化是植物組織培養(yǎng)繼代過程中普遍存在的現(xiàn)象，表現(xiàn)為從愈傷組織團(tuán)塊一小部分組織開始褐變發(fā)黑，隨后褐化逐漸蔓延整個(gè)愈傷組織，致使愈傷組織停止生長(zhǎng)分化，直至死亡。將初代培養(yǎng)出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，一方面能夠?yàn)橛鷤M織提供新的培養(yǎng)條件，加快愈傷組織的生長(zhǎng)速度，由于褐化主要與組織細(xì)胞內(nèi)多酚氧化酶在氧化酚類物質(zhì)成醌類物質(zhì)有關(guān)，所以愈傷組織在快速生長(zhǎng)的同時(shí)，愈傷組織褐化也隨之加快，從而影響植物組織培養(yǎng)后續(xù)正常進(jìn)行[46]。因此，控制愈傷組織褐化是保障許多植物組織培養(yǎng)順利完成的重要步驟。

對(duì)于控制愈傷組織褐化現(xiàn)象的研究，前人主要是從抗褐化劑、植物激素、培養(yǎng)方式等方面進(jìn)行探索。陳劍勇[47]使用維生素C、檸檬酸、半胱氨酸、硫代硫酸鈉 4種抗氧化劑對(duì)杉木愈傷組織進(jìn)行防褐化研究發(fā)現(xiàn)，維生素C與半胱氨酸能有效抑制褐化，且對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用。張彥波等[48]在對(duì)喜樹愈傷組織抑制褐化的研究中發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織繼代過程中SH培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基的愈傷組織褐化率要低，并且加入抗壞血酸與活性炭也能有效降低愈傷組織褐化率。唐利球等[49]在對(duì)金錢樹愈傷組織繼代中，采用液體培養(yǎng)與使用N6培養(yǎng)基都能夠改善愈傷組織在繼代過程中的褐化現(xiàn)象。張明文等[50]在銀杏組織培養(yǎng)的愈傷組織繼代褐化方面研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加不同濃度與種類的糖，造成滲透壓不同，5%蔗糖濃度對(duì)防褐化效果最好，并且不同品種的銀杏在愈傷組織繼代過程中，褐化程度不同。

4 結(jié)語

木本組織培養(yǎng)技術(shù)通過這些年的發(fā)展，雖然已經(jīng)在不少木本植物品種上取得一定的進(jìn)展，但普遍仍存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)困難，組培苗移栽成活率低，難以真正實(shí)現(xiàn)優(yōu)良種苗的高效繁育的問題[51-53]。對(duì)于許多木本植物尤其是熱帶作物，因處于高溫高濕的環(huán)境下，導(dǎo)致進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)生菌污染嚴(yán)重。木本植物的組織培養(yǎng)技術(shù)在不同品種上的發(fā)展進(jìn)度嚴(yán)重不一致，由此筆者希望通過對(duì)不同木本植物品種組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行概述，讓組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展存在瓶頸的植物品種能夠參考其他相近品種的成功案例，從外植體消毒滅菌、基本培養(yǎng)基的選擇、不同植物激素的配比與培養(yǎng)方法等方面有所突破，完成對(duì)優(yōu)良種苗、珍稀物種、工廠化操作的快速高通量繁育的目標(biāo)。