高博，胡芳芳，高艷鳳

論著

Vasostatin-1對缺氧復氧腎小管上皮細胞炎性損傷的影響

高博，胡芳芳，高艷鳳

探討血管生成抑制因子vasostatin-1（VS-1）對缺氧復氧腎小管上皮細胞的炎性損傷作用及機制。

采用缺氧復氧方式制造腎小管上皮細胞炎性損傷。構建慢病毒載體并以脂質體法將shVS-1 轉染 NRK-52E 細胞。ELISA 法檢測細胞中 LDH 和 IL-1β 含量；Western blot 檢測細胞中 VS-1、pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白表達。

與對照組相比，缺氧復氧組細胞 LDH 和 IL-1β 含量顯著升高，且 VS-1 蛋白表達顯著升高。成功構建沉默 VS-1 的慢病毒載體，且轉染缺氧復氧 NRK-52E 細胞，可降低細胞中 LDH 和 IL-1β 含量、降低 caspase-1 蛋白表達，過表達 VS-1 則具有相反的功能。

沉默 VS-1 可保護缺氧復氧腎小管上皮細胞的炎性損傷，可能與下調(diào) caspase-1 有關，可為急性腎損傷的臨床治療提供依據(jù)。

Vasostatin-1； 缺氧復氧； 腎小管上皮細胞； 炎性損傷； 炎性因子

急性腎損傷又稱急性腎衰竭，是一種涉及多種疾病的臨床常見危重病癥[1]。醫(yī)院患者急性腎損傷的發(fā)生率在 1.4% ~ 25.9%，死亡率為 60.3%[2]。炎癥反應是引起缺血再灌注腎損傷的重要原因，腎小管上皮細胞為缺血再灌注腎損傷的重要效應細胞，是腎臟炎癥介質的關鍵[3]。血管生成抑制因子vasostatin-1（VS-1）是在應激狀態(tài)下由脊椎和無脊椎動物神經(jīng)、內(nèi)分泌以及彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)釋放的嗜鉻粒蛋白 A 通過組織特異性加工程序產(chǎn)生的N 端 1 ~ 76 酶解多肽片段，具有舒張血管、促進機體固有免疫、調(diào)節(jié)細胞黏附等多種組織非特異性穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用[4-6]。各種炎癥因子，如腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長因子，造成內(nèi)皮細胞損傷、內(nèi)皮屏障功能紊亂和血管滲漏以吸引炎癥中單核巨噬細胞聚集、黏附內(nèi)皮、遷入內(nèi)皮下間隙形成泡沫細胞[7]。VS-1 具有促進血管舒張，減少內(nèi)皮細胞的趨化、增殖、血管滲漏及抑制炎癥細胞黏附的功能[8]。VS-1 在冠狀動脈病變組織中低表達，但在外傷或炎癥應激狀態(tài)下表達明顯升高[9]。但 VS-1 在炎癥狀態(tài)下升高的機制尚未闡明。VS-1 在慢性結腸炎和腫瘤新生血管形成中均有報道[10-11]。大量研究報道 VS-1 在缺血性心臟疾病的防治中具有很大潛力。但 VS-1 在急性腎損傷中的作用機制尚未完全清楚。本研究將建立缺氧復氧（H/R）腎小管上皮細胞損傷，構建沉默 VS-1 的慢病毒載體和沉默 VS-1 的缺氧復氧腎小管上皮細胞，觀察沉默 VS-1 對缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷和炎癥因子 caspase-1 的影響，揭示沉默 VS-1 可保護缺氧復氧腎小管上皮細胞的損傷，可能與下調(diào) caspase-1 有關，為急性腎損傷的臨床診斷治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎小管上皮細胞 NRK-52E 購自 ATCC 細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、DH5α 感受態(tài)細胞、HQ 高純度質粒抽提試劑盒、LipofectamineTM2000、PUC-T 載體連接試劑盒、R I、I 內(nèi)切酶均購自北京康為世紀生物科技有限公司；PVDF 膜購于德國羅氏診斷有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；IL-1β 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；凝膠成像分析儀購自日本柯達公司；半干轉膜儀購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E，置于 37 ℃、5% CO2和 95% 空氣的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 缺氧復氧腎小管上皮細胞模型 當細胞長到對數(shù)生長期時，用無血清的 DMEM 培養(yǎng)基處理細胞 24 h，培養(yǎng)液用不含血清和抗生素的磷酸鹽緩沖液、換用 1% O2+ 94% N2+ 5% CO2混合氣體的37 ℃缺氧箱中缺氧培養(yǎng) 4 h。然后復氧培養(yǎng)，如 1.2.1 培養(yǎng)方法培養(yǎng) 3、6、12 和 24 h，收集細胞及培養(yǎng)液上清。

1.2.3 構建沉默 VS-1 的慢病毒載體 shVS-1 核苷酸序列由美國 Invitrogen 公司合成，然后將 shVS-1 插入到表達載體 PUC-T，4 ℃連接過夜，瞬時轉化至感受態(tài)細胞 DH5α，然后搖菌培養(yǎng)，涂板過夜培養(yǎng)。挑取單克隆株擴大培養(yǎng)，用 HQ 高純度質粒抽提試劑盒提取質粒。構建質粒 shVS-1，最后將其轉化至感受態(tài)細胞 DH5α 中。在轉化平板中挑取克隆株并驗證其是否與插入基因片段一致。

1.2.4 細胞轉染 將構建載體 shVS-1、Scrambled 和 pcDNA、pcDNA-VS-1 用LipofectamineTM2000 轉染到常規(guī)培養(yǎng)的 NRK-52E 細胞。然后進行缺氧復氧培養(yǎng) 12 h。轉染-制造細胞損傷成功后用于酶聯(lián)免疫吸附試驗、Western blot 實驗。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗 按照檢測試劑盒的技術手冊檢測細胞中 LDH 和 IL-1β 含量。

1.2.6 Western blot 實驗 取適量缺氧復氧處理 12 h 的 NRK-52E 細胞和轉染細胞，RIPA 裂解液裂解后，提取總蛋白，BCA 法蛋白定量后變性，按照 Western blot 實驗步驟進行操作。以目的條帶灰度值與內(nèi)參 GAPDH 灰度值的比值表示目的蛋白 VS-1、pro-caspase-1、caspase-1 的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 缺氧復氧腎小管上皮細胞的炎性損傷

缺氧復氧處理大鼠腎小管上皮細胞 NRK-52E 3、6、12 和 24 h，和對照組相比，LDH 含量均顯著升高（圖 1A），IL-1β 含量均顯著升高（圖 1B），差異均具有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。最佳致 NRK-52E 細胞損傷時間為 12 h。

圖 1 缺氧復氧處理不同時間的腎小管上皮細胞 NRK-52E 的炎性損傷（A：LDH 的含量；B：IL-1β 的含量；*P < 0.05）

Figure 1 Inflammatory injury of renal tubular epithelial cells NRK-52E at different time after hypoxia reoxygenation (A: LDH content; B: IL-1β content;*< 0.05)

圖 2 缺氧復氧腎小管上皮細胞中 VS-1 蛋白表達升高（*P < 0.05）

Figure 2 Increased expression of VS-1 protein in hypoxic reoxygenated renal tubular epithelial cells (*< 0.05)

2.2 缺氧復氧腎小管上皮細胞中 VS-1 高表達

運用 Western blot 檢測缺氧復氧處理 12 h 的 NRK-52E 細胞中 VS-1 的蛋白表達，與對照組相比，VS-1 的蛋白表達量顯著升高（圖 2，< 0.05）。

2.3 構建沉默 VS-1 的慢病毒載體

如圖 3 所示，與 Scrambled 慢病毒載體相比，shVS-1 慢病毒載體中 VS-1 的蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（< 0.05）?？梢姡晒嫿ǔ聊?VS-1 的慢病毒載體。

2.4 沉默 VS-1 減輕缺氧復氧對腎小管上皮細胞的炎性損傷

shVS-1 組與 Scrambled 組相比，腎小管上皮細胞中 LDH 含量顯著降低（圖 4A），IL-1β 含量顯著降低（圖 4B），差異均具有統(tǒng)計學意義（< 0.05）?？梢?，沉默 VS-1 可減輕缺氧復氧對腎小管上皮細胞的炎性損傷。

2.5 沉默 VS-1 抑制缺氧復氧腎小管上皮細胞 VS-1 蛋白表達

如圖 5 所示，轉染 shVS-1 組細胞與轉染 Scrambled 組相比，VS-1 蛋白表達顯著降低（< 0.05）。

2.6 沉默 VS-1 下調(diào)缺氧復氧腎小管上皮細胞 caspase-1

如圖 6 所示，shVS-1 組細胞與 Scrambled 組相比，caspase-1 蛋白表達顯著降低（< 0.05），pro-caspase-1 蛋白表達差異不顯著（> 0.05）。

圖 3 沉默 VS-1 對慢病毒載體中 VS-1 蛋白表達的影響（*P < 0.05）

Figure 3 Effect of silencing VS-1 on VS-1 protein expression in lentiviral vectors (*< 0.05)

圖 4 沉默 VS-1 減輕缺氧復氧對腎小管上皮細胞的炎性損傷（A：對 LDH含量的影響；B：對 IL-1β 含量的影響；*P < 0.05）

Figure 4 Silencing VS-1 attenuated inflammatory injury to renal tubular epithelial cells by hypoxia reoxygenation (A: Effect on LDH content; B: Effect on IL-1β content;*< 0.05)

圖 5 沉默 VS-1 抑制缺氧復氧腎小管上皮細胞 VS-1 蛋白表達（*P < 0.05）

Figure 5 Silencing VS-1 inhibited VS-1 protein expression in hypoxic reoxygenation renal tubular epithelial cells (*< 0.05)

圖 6 沉默 VS-1 下調(diào)缺氧復氧腎小管上皮細胞caspase-1（*P < 0.05）

Figure 6 Silencing VS-1 down-regulated caspase-1 in hypoxic reoxygenation renal tubular epithelial cells (*< 0.05)

圖 7 VS-1 過表達對缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷的影響（A：免疫印跡圖；B：VS-1 蛋白相對表達量；C：對pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達的影響；D：對 LDH含量的影響；E：對 IL-1β含量的影響；*P < 0.05）

Figure 7 Effects of VS-1 overexpression on oxygenation of renal tubular epithelial cells (A: Immunoblot; B: Relative expression of VS-1 protein; C: Effect on pro-caspase-1, caspase-1 protein expression; D: Effect on LDH content; E: Effect on IL-1β content;*< 0.05)

2.7 VS-1 過表達對缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷的影響

結果如圖 7 所示，與 pcDNA 組相比，pcDNA-VS-1 組細胞中 VS-1 的表達水平明顯升高，caspase-1 蛋白表達顯著升高，LDH、IL-1β 含量均顯著升高（< 0.05）。

3 討論

Vasostatin 類多肽在心血管循環(huán)系統(tǒng)中起到平衡調(diào)節(jié)作用，具有保護血管系統(tǒng)抵抗強烈興奮和應激刺激的作用[12]。VS-1 在心肌細胞缺血再灌注損傷中的研究非常普遍，VS-1 的復性肌力作用、抗心肌缺血再灌注損傷及抗心律失常作用已得到認可[13-14]。目前關于 VS-1 與細胞炎癥因子的研究甚少。童玉娜[15]在缺氧復氧誘導的腎小管上皮細胞炎癥反應的研究中闡明，缺氧復氧可上調(diào)腎小管上皮細胞中 IL-1β 和 caspase-1 表達，且成熟的 IL-1β 表達與 caspase-1 的表達相一致。本研究建立缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷，運用 Western blot 檢測 VS-1 蛋白表達發(fā)現(xiàn)，在缺氧復氧腎小管上皮細胞中 VS-1 高表達且可上調(diào) LDH 和 IL-1β。這些發(fā)現(xiàn)表明 VS-1 的表達與腎小管上皮細胞損傷分泌的炎性因子呈劑量依賴性。

VS-1 在不同生物中的作用機制是具有種屬特異性的，其對蛙和鰻魚心臟鈣/鈉通道的依賴性不同[16-18]。王錚[19]在心肌缺血再灌注損傷的研究中，通過構建腺病毒重組的 VS-1 基因，并轉染大鼠心肌細胞和大鼠血管內(nèi)皮細胞，運用 MTT 法檢測細胞活力，Annexin-V-FITC 流式細胞術檢測細胞凋亡，揭示了 VS-1 在心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞中具有顯著的抗缺氧復氧損傷作用。Liu 等[20]研究闡明，過表達 VS-1 可保護缺氧復氧心肌細胞-血管內(nèi)皮細胞的損傷。

本研究構建慢病毒介導的沉默 VS-1 的缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷，運用 ELISA 法檢測 LDH 和 IL-1β 含量發(fā)現(xiàn)，沉默 VS-1 可下調(diào) LDH 和 IL-1β，可保護缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷，過表達 VS-1 則具有相反的作用，揭示了 VS-1 在急性腎損傷中的作用。VS-1 在缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷中的作用與心肌缺血再灌注損傷中的作用相反。

IL-1β 是炎癥反應早期產(chǎn)生的多潛能細胞因子，可誘導 TNFα、IL-6、IL-8 等細胞因子的產(chǎn)生，是引起腎小管上皮細胞炎性損傷和凋亡的重要效應分子[21]。Caspase-1 是 IL-1β 轉化酶，其為哺乳動物體內(nèi)剪切促炎因子 IL-1β 的特異蛋白酶，可將 pro-IL-1β 剪切為成熟的 IL-1β[22-23]。Gasman 等[24]研究運用 ELISA 法檢測腸源和胰源內(nèi)分泌腫瘤患者血清和正常人血清中 CgA 和 VS-1 的表達，揭示促生長抑制素治療可上調(diào)患者血清中的 CgA 但不影響 VS-1 的表達水平，提示 VS-1 可作為腸源和胰源內(nèi)分泌腫瘤的診斷標記物。Rumio 等[10]在研究慢性結腸炎時，建立 DSS 誘導的鼠急性和慢性結腸炎模型，LPS 誘導的腸黏膜上皮細胞損傷，運用 ELISA 法檢測 VS-1、IL-8、CK 的含量，發(fā)現(xiàn) VS-1 抑制損傷細胞分泌TNFα、干擾素 c，且在動物模型中具有保護作用，揭示 VS-1 在動物體內(nèi)具有治療作用，該機制可能與抑制腸道的滲透力，對損傷腸黏膜的修復和抑制 IL-8/KC 及其他炎性因子的產(chǎn)生有關。本研究在前人的基礎上建立沉默 VS-1 的慢病毒介導的缺氧復氧腎小管上皮細胞損傷模型，運用 Western blot 法檢測細胞中 caspase-1、pro-caspase-1 的蛋白表達，揭示沉默VS-1 可抑制缺氧復氧腎小管上皮細胞中 caspase-1的蛋白表達，提示沉默 VS-1 可抑制炎癥因子的分泌。這將為 VS-1 在不同種屬、不同組織中的特異性研究提供參考依據(jù)。

總之，沉默 VS-1 可保護缺氧復氧腎小管上皮細胞的炎性損傷，其可能與下調(diào) caspase-1 有關，可作為臨床治療急性腎損傷的理論依據(jù)。

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Effect of vasostatin-1 on inflammatory damage of hypoxic reoxygenation in renal tubular epithelial cells

GAO Bo, HU Fang-fang, GAO Yan-feng

To study the inflammatory injury mechanism of vasostatin-1 (VS-1) in renal tubular epithelial cells by hypoxic reoxygenation.

Inflammatory injury of kidney tubular epithelial cells was established by hypoxia reoxygenation. The lentiviral vector of shVS-1 was transfected into NRK-52E cells by liposome method. LDH and IL-1β levels in cells were detected by ELISA. The protein expression of VS-1, pro-caspase-1 and caspase-1 in cells were detected by Western blot.

Compared with the control group, the levels of LDH and IL-1β in the hypoxia reoxygenation group were significantly increased, and the protein expression of VS-1 was significantly increased. The lentiviral vector was successfully constructed. Transfection of silencing VS-1 lentiviral vector into NRK-52E cells with hypoxic reoxygenation could decrease LDH and IL-1β levels and downregulate caspase-1 expression, but overexpression of VS-1 possessed the opposite function.

Silencing VS-1 could protect the kidney tubular epithelial cells with hypoxic reoxygenation from inflammatory injury, which may be related to the down-regulation of caspase-1, which will provide a basis for clinical treatment of acute kidney injury.

Vasostatin-1; Hypoxia reoxygenation; Renal tubular epithelial cells; Inflammatory injury; Inflammatory factors

GAO Bo, Email: dongji991@163.com

Author Affiliation: Department of Nephrology, The People's Hospital of Anyang City, Henan 455000, China

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.010

455000 河南，安陽市人民醫(yī)院腎內(nèi)科

高博，Email：dongji991@163.com

2019-07-05