胡 彥，劉 潔，馮 鑫，沈 靜，余鋒平，陳立書(shū)

耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)是嚴(yán)重危害公眾健康的疾病。我國(guó)是全球30個(gè)MDR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，2017年估算我國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者88.9萬(wàn)例，耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者7.3萬(wàn)例，新患者和復(fù)治患者M(jìn)DR/RR-TB的發(fā)生率分別為7.1%和24%[1]。重慶地區(qū)MDR-TB發(fā)生率為23.0%[2]，是結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的高發(fā)區(qū)。

二線注射類(lèi)藥物是組成MDR-TB治療方案的重要藥物之一，在進(jìn)行短程化療方案之前，注射類(lèi)藥物的耐藥性應(yīng)常規(guī)檢測(cè)[3-4]。傳統(tǒng)藥敏耗時(shí)長(zhǎng)，應(yīng)用快速可靠的分子檢測(cè)技術(shù)成為必然趨勢(shì)。由于不同地區(qū)菌株研究人群、流行病學(xué)和藥物實(shí)際使用情況等不同，菌株耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)存在地域差異。此外，北京基因型菌株是中國(guó)的主要流行株，有更高的耐藥基因突變頻率，在耐藥結(jié)核病的傳播中起著重要作用[5-7]，因此明確重慶地區(qū)注射類(lèi)藥物耐藥表型與基因突變的相關(guān)性，并對(duì)不同基因型的耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，將為本地區(qū)合理應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行注射類(lèi)藥物耐藥性檢測(cè)及合理制定MDR-TB化療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來(lái)源 收集2015年1月至2017年6月重慶市39個(gè)區(qū)(縣)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)967例痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性的MDR-TB可疑患者臨床分離株，經(jīng)菌種鑒定及比例法藥敏試驗(yàn)，確定為MDR-TB菌株229株(23.7%)，分離自229例MDR-TB患者。男173例，女56例；年齡17～79歲，平均(45.0±15.9)歲；初治患者84例，復(fù)治患者145例。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv(ATCC27294)來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要儀器和試劑 PCR儀購(gòu)自杭州博日公司，Middle brook 7H9培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，Alamar blue顯色液購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)和卷曲霉素(Cm)藥粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1藥敏試驗(yàn) 使用7H9液體培養(yǎng)基(7H9∶OADC=9∶1)，通過(guò)微孔板Alamar blue顯色法測(cè)定注射類(lèi)藥物的MIC值。Km、Cm濃度梯度設(shè)置：0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL；Am濃度梯度設(shè)置：0.63、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL。刮取改良L-J(Lowenstein-Jenden)培養(yǎng)基上肉眼可見(jiàn)后1至2周的新鮮菌落，進(jìn)行磨菌、比濁，制備1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙海?0倍稀釋后取100 μL接種到不同濃度梯度的7H9液體培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)7 d后，加入70 μL顯色劑(Alamar blue∶5% Tween 80=2∶5)，24 h后觀察顏色變化判斷MIC讀數(shù)。MIC界定標(biāo)準(zhǔn)：藍(lán)色完全沒(méi)有發(fā)生改變的為最小藥物濃度。耐藥臨界濃度參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)置，Km、Cm為2.5 μg/mL，Am為1.0 μg/mL。

1.2.2耐藥基因擴(kuò)增和測(cè)序 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rrs、eis、tlyA基因序列在NCBI主頁(yè)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank )中査取獲得，使用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μL、引物各1 μL，DNA模板3 μL，去離子水20 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)BioEdit (Version 7.1.3.0)軟件與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3熒光PCR-熔解曲線基因分型 Rv2952基因用于鑒定北京與非北京基因型。參照文獻(xiàn)[10-13]，引物和探針序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，采用10 μL反應(yīng)體系：10×反應(yīng)緩沖液1 μL、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 0.4 μL、上游引物0.05 μL(0.02 μmol/L)、下游引物1 μL(0.4 μmol/L)、探針0.2 μL(0.2 μmol/L)、酶 0.2 μL、DNA 0.5 μL、雙蒸水6.65 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 2 min; 變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)，最終延伸72 ℃ 5 min。熔解曲線分析條件為：95 ℃變性5 min，40～80 ℃熔解曲線分析，每升高1 ℃采集1次熒光，檢測(cè)FAM和ROX 2個(gè)通道。

表1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序反應(yīng)用的引物序列

Tab.1 PCR primer sequences used for amplification and sequencing

引物序列(5′-3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpTm(℃)rrs-FGCGCAACCCTTGTCTCAT-GTTG46460rrs-RGGGGCGTTTTCGTGGT-GCTCCeis-FGCGTAACGTCACG-GCGAAATTC56758eis-RGTCAGCTCATGCAAGGTGtlyA-FGCATCGCACGTCGTCTTT94758tlyA-RGGTCTCGGTGGCTTCGTC

1.2.4相關(guān)定義及結(jié)果解釋 耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是指至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。Km、Cm高、中、低水平耐藥，分別為MIC≥80 μg/mL、MIC=40 μg/mL、MIC=2.5～20 μg/mL。Am高、中、低水平耐藥，分別為MIC≥64 μg/mL、MIC=32 μg/mL、MIC=1～16 μg/mL[8]。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本率的比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法(樣本量<40或理論頻數(shù)<1時(shí))，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1MDR-TB菌株三種二線注射類(lèi)藥物體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果 229株MDR菌株中，35株(15.3%，35/229)對(duì)至少一種二線注射類(lèi)藥物耐藥。34株(14.8%，34/229)對(duì)Km耐藥，27株(11.8%，27/229)對(duì)Am耐藥(同時(shí)耐Km)，19株(8.3%，19/229)對(duì)Cm耐藥(其中，18株對(duì)Km和Am耐藥,1株對(duì)Km敏感)。

2.23種二線注射類(lèi)藥物MIC分布與耐藥相關(guān)基因分子特征 35株注射類(lèi)耐藥表型菌株中，28株(80.0%)發(fā)生基因突變，包括rrs、eis啟動(dòng)子區(qū)和tlyA3個(gè)基因的5種突變類(lèi)型。其中，21株(60%，21/35)發(fā)生rrs基因A1401G突變，突變頻率最高。該21株A1401G突變株中，18株對(duì)Km高水平耐藥，3株Km中度水平耐藥，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.429，P<0.01)；Am在21株A1401G突變株中，18株為高水平耐藥，2株中度水平耐藥，1株Am敏感，與Am高水平耐藥相比，后兩者與其差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.436，P<0.01；χ2=27.776，P<0.011)。Cm在21株A1401G突變株中的MIC值范圍從0.31 μg/ml到80 μg/ml不等(高水平、低水平耐藥及敏感株分別為1株、12株和8株)。35株耐藥表型菌株中，1株發(fā)生rrs基因G1484T突變，對(duì)Km、Am均顯示為高水平耐藥，Cm顯示為低水平耐藥。在4株eis啟動(dòng)子區(qū)G(-10)A突變株中，Km均為低水平耐藥；Am 1株為低水平耐藥，3株敏感；Cm 4株均為敏感。1株發(fā)生eis啟動(dòng)子區(qū)C(-14)T突變，對(duì)Km、Am均顯示為低水平耐藥，對(duì)Cm敏感。1株發(fā)生tlyA基因137位堿基插入改變，對(duì)Cm低水平耐藥而對(duì)Km、Am均敏感。見(jiàn)表2。

2.33種二線注射類(lèi)藥物耐藥表型與基因突變之間的關(guān)系 在3種注射類(lèi)藥物耐藥和敏感表型間，經(jīng)卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，Km耐藥和敏感表型間的rrs、eis基因啟動(dòng)子區(qū)突變率差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Am、Cm耐藥和敏感表型間，僅rrs基因突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表3所示。

2.4不同基因型菌株二線注射類(lèi)藥物耐藥情況 229株MDR菌株中，北京基因型菌株190株(83.0%，190/229)，非北京基因型菌株39株(17.0%，39/229)，雖然北京型各注射類(lèi)藥物耐藥率高于非北京型，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

表2 MDR-TB 菌株rrs、eis和tlyA基因分子特征與最低抑菌濃度分布

Tab.2 MICs for second-line injectable drugs and mutant profiles of the genesrrs,eis, andtlyAamong MDR-TB isolates

耐藥表型(株數(shù))rrs基因突變eis啟動(dòng)子區(qū)突變tlyA基因突變突變株數(shù)[n(%)]MIC (μg/mL)KmAmCmA1401G21(60.0)40.0～>80.01.0～>64.00.31～>80.0二線注射-耐藥G1484T1(2.9)>80.0>64.05.0 (35)G(-10)A4(11.4)5.0～10.00.5～2.00.63～1.25C(-14)T1(2.9)10.0 2.0 1.25 137位插入G1(2.9)2.5 0.5 5.0 Total28(80.0)2.5～>80.00.5～>64.00.31～>80.0A1449G4(2.1)1.25～2.50.25～0.50.63～2.5二線注射-敏感 Glu132Ala1(0.5)2.50.250.63 (194)396位插入A1(0.5)1.250.1251.25 Total6(3.1)1.25～2.50.125～0.50.63～2.5

表3 MDR結(jié)核分枝桿菌注射類(lèi)藥物耐藥與基因突變的關(guān)系

Tab.3 Relationship between gene mutations and injectable drug resistance in MDR strains

藥物基因耐藥[n(%)]突變無(wú)突變小計(jì)敏感[n(%)]突變無(wú)突變小計(jì)χ2PKmrrs22(64.7)12(35.3)344(2.1)191(97.9)195106.78<0.01①eis5(14.7)29(85.3)340(0.0)195(100.0)195-<0.01②Amrrs21(77.8)6(22.2)274(2.0)198(98.0)202133.01<0.01①eis1(3.7)26(96.3)270(0.0)202(100.0)202 -0.12②Cmrrs14(73.7)5(26.3)1912(5.7)198(94.3)21073.37<0.01①eis0(0.0)19(100.0)195(2.4)205(97.6)210 -1.00②tlyA1(5.3)18(94.7)2102(1.0)208(99.0)210 -0.23②

注： ①校正卡方檢驗(yàn)，②Fisher確切概率法

表4 不同基因型二線注射類(lèi)藥物耐藥情況

Tab.4 Second-line injectable drugs resistance among Beijing and non-Beijing genotypes

基因型耐藥株數(shù)[n(%)]KmAmCm北京型(n=190)31(16.3)24(12.6)16(8.4)非北京型(n=39)3(7.7)3(7.7)3(7.7)χ2值1.0930.358 0.000 P值0.1680.5491.000

2.5不同基因型菌株二線注射類(lèi)藥物耐藥基因突變情況 在35株注射類(lèi)藥物耐藥菌株中，北京型和非北京型分別為31株(88.6%)和4株(11.4%)。在31株北京基因型菌株中，24株(77.4%，24/31)存在rrs、eis和tlyA基因突變。4株非北京型菌株均發(fā)生rrs、tlyA基因突變。各耐藥基因在北京與非北京型間的突變情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。

表5 35株二線注射類(lèi)藥物耐藥株不同基因型間基因突變情況[n(%)]

Tab.5 Distribution of different mutations of 35 resistant isolates among Beijing and non-Beijing genotypes

基因型rrseistlyAA1401GG1484TG(-10)AC(-14)T137位插入G無(wú)突變北京型(n=31)18(58.1)1(3.2)4(12.9)1(3.2)0(0.0)7(22.6)非北京型(n=4)3(75.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)1(25.0)0(0.0)P值①0.6351.000 1.000 1.000 0.1140.562

注：①Fisher確切概率法

3 討 論

二線注射類(lèi)藥物是組成MDR-TB治療方案的重要藥物，其中，Km、Am屬于氨基糖苷類(lèi)，Cm屬于多肽類(lèi)藥物。已有研究表明，氨基糖苷類(lèi)Km以及它的衍生物Am是通過(guò)修飾16S rRNA的核糖體小體結(jié)構(gòu)抑制蛋白質(zhì)合成，氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥的產(chǎn)生與16S rRNA編碼基因rrs突變相關(guān)[14-16]。本研究35株三種二線注射類(lèi)藥物耐藥株中，21株(60%)發(fā)生rrs基因A1401G突變，突變頻率最高，與文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的一致。在21株A1401G突變株中，Cm呈現(xiàn)不同的MIC變化水平，Km、Am高水平耐藥株均明顯多于中低水平耐藥株，rrs基因A1401G突變與Km、Am高水平耐藥相關(guān)。此外，rrs基因A1401G突變是Km、Am和Cm發(fā)生交叉耐藥的分子基礎(chǔ)[14-17]。本研究重慶地區(qū)Km、Am和Cm耐藥菌株rrs基因突變率分別為64.7%、77.8%、73.7%，與敏感株有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故以rrs基因作為診斷標(biāo)記物，應(yīng)用于本地區(qū)二線注射類(lèi)藥物的耐藥性檢測(cè)是可行的。

eis基因啟動(dòng)子區(qū)突變提高了Eis蛋白表達(dá)水平，使氨基糖苷類(lèi)藥物乙?；@著上升，加劇了耐藥性的產(chǎn)生[18]。本研究eis啟動(dòng)子區(qū)突變率為14.3%(5/35)，分別低于泰國(guó)、法國(guó)及浙江和江蘇五區(qū)縣的17.2%、44.0%及26.4%[14,16,19]。4株eis啟動(dòng)子區(qū)G(-10)A突變及1株C(-14)T突變株均為Km低水平耐藥，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的一致。泰國(guó)則報(bào)道eis啟動(dòng)子區(qū)突變表現(xiàn)為Km高水平耐藥，可能為其他未知的耐藥機(jī)制與eis啟動(dòng)子區(qū)突變同時(shí)發(fā)生[14]。eis基因啟動(dòng)子區(qū)突變僅在Km耐藥與敏感表型間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Am、Cm耐藥關(guān)聯(lián)不大。由于eis基因啟動(dòng)子區(qū)其較低的突變率，可與rrs基因聯(lián)合對(duì)Km耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。

雖然Cm屬于多肽類(lèi)藥物，但其耐藥機(jī)制與氨基糖苷類(lèi)藥物相似，除與編碼16S rRNA的rrs基因發(fā)生突變有關(guān)外，編碼2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的tlyA基因突變是Cm耐藥性產(chǎn)生的重要原因，其突變導(dǎo)致rRNA無(wú)法被甲基化，核糖體功能受到影響而引起Cm耐藥[20]。本研究?jī)H1株Cm耐藥株發(fā)生tlyA基因137位堿基插入改變，tlyA基因突變?cè)贑m耐藥和敏感表型間無(wú)顯著差異，tlyA基因突變與Cm耐藥的關(guān)系還需進(jìn)一步證實(shí)。雖然有若干文獻(xiàn)[14,17,20-21]報(bào)道tlyA基因突變涉及Cm耐藥，但由于其較低的突變頻率及突變類(lèi)型的多樣性，用于分子快速檢測(cè)，tlyA基因并不是一個(gè)合適的靶標(biāo)。

北京基因型菌株在重慶地區(qū)MDR-TB菌株中占83.0%，為本地區(qū)主要的流行株，與來(lái)自全國(guó)的數(shù)據(jù)一致[5]。各二線注射類(lèi)藥物的耐藥性及耐藥基因突變情況在北京與非北京基因型間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明本地區(qū)二線注射類(lèi)藥物耐藥與北京基因型并無(wú)相關(guān)性。

此外，需要引起注意的是有13株(5.7%，13/229)PCR測(cè)序與表型藥敏結(jié)果不一致。在35株注射類(lèi)藥物耐藥株中7株(20.0%，7/35)未發(fā)現(xiàn)任何rrs、eis啟動(dòng)子區(qū)和tlyA基因突變，提示細(xì)胞壁滲透性降低、藥物外排泵等其他耐藥機(jī)制的存在，也可能與異質(zhì)性耐藥有關(guān)，即標(biāo)本中敏感菌和耐藥菌并存，低比率的耐藥菌無(wú)法用分子藥敏方法檢出[22]。關(guān)于4株rrs基因突變及2株tlyA基因突變但表型敏感的菌株，其MIC水平多處于關(guān)鍵濃度值及其以下附近，可能與結(jié)果判讀、菌體活性、藥物濃度等操作因素或其他引起不準(zhǔn)確因素有關(guān)。所以，分子藥敏試驗(yàn)方法并不能完全取代表型藥敏方法，兩者可互為補(bǔ)充以提高對(duì)藥物敏感性結(jié)果的正確判讀，為MDR-TB患者化療方案的制定提供可靠依據(jù)。

利益沖突：無(wú)