葉雅芳,劉德星,李婷婷,邱德義,劉環(huán)宇
蠓科(Ceratopogonidae)是雙翅目(Diptera)中種類繁多、分布甚廣的體型較小的昆蟲,部分刺吸人畜血液的種類被稱為吸血蠓,其中庫蠓屬(Culicoides)是分布最廣、種類最多、與人畜關(guān)系最密切的吸血蠓之一。庫蠓全世界分布,約有1 400多種,在我國分布有347種[ 1-2]。庫蠓不但刺吸人畜血液引起蟲咬性皮炎和皮膚過敏性癥狀,而且還是奧柔普西病毒病(Oropouche virus,OROV)、藍(lán)舌病毒(Bluetongue virus, BTV)、施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)、等多種人畜病原體的傳播媒介[3]。家畜流行病對(duì)畜牧業(yè)影響巨大,歐洲BTV和SBV的大暴發(fā)曾造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。了解庫蠓的種類、分布、吸血特性及病原體攜帶率是有效預(yù)防控制疫病流行和傳播的關(guān)鍵,因此庫蠓的準(zhǔn)確鑒定對(duì)于蠓傳疾病的研究和防控有著重要的意義。
由于雌蠓才具吸血習(xí)性,對(duì)疾病的傳播具有重要意義,因此雌蠓的分類鑒定尤其重要,但傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法是根據(jù)成蟲外部形態(tài)特征以及雄蟲的尾器才能進(jìn)行有效鑒定,而雌蟲、幼蟲或肢體殘缺的蟲體難以辯認(rèn),且蠓類中有效的形態(tài)鑒定特征極少,對(duì)近似種的分類鑒定十分困難,從而影響庫蠓地理分布及其傳播疾病的深入研究[6-7]。近年來,隨著研究人員對(duì)線粒體DNA的深度挖掘和廣泛應(yīng)用,線粒體DNA已成為昆蟲物種分類和分子序列分析的一種有效分子標(biāo)記,如線粒體COI基因和Cytb基因片段[8-12]。
中山市位于東經(jīng)113°9′2″至113°46′,北緯22°11′12″至22°46′35″,位于珠江三角洲中部偏南的西、北江下游出海處,處于北回歸線以南,熱帶北緣,光照充足,熱量豐富,氣候溫暖,冬季氣候變化緩和,地理?xiàng)l件和氣候條件均適合蠓類生長(zhǎng),且目前尚未見到學(xué)者系統(tǒng)開展中山市庫蠓的調(diào)查研究。本研究以臺(tái)灣蠛蠓Lasioheleataiwana、叢林鋏蠓Forcipomyiabessa、美島裸蠓Atrichopogonformosanus、彎曲阿蠓Alluaudomyiaflexuosa為外群,對(duì)2018年4月至2019年3月在中山市不同生境采集的庫蠓進(jìn)行系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定以及COI基因和Cytb基因序列分析,為研究我國庫蠓快速、準(zhǔn)確的分類鑒定提供資料,也為進(jìn)一步研究其種群分布、種群遺傳結(jié)構(gòu)及其傳播相關(guān)疾病的防控提供科學(xué)依據(jù)。
1.1.1庫蠓標(biāo)本 本研究所用的104只庫蠓(13只雄蟲,91只雌蟲)為2018年4月至2019年3月采集于中山市不同生境(詳細(xì)信息見表1)。
表1 12種庫蠓的詳細(xì)信息
Tab.1 Information ofCulicoidesin this study
種名拉丁學(xué)名雄♂雌♀采集地GenBank序列號(hào)COICytb原野庫蠓Culicoides homotomus1♀6MK917544MK917648蘇島庫蠓Culicoides sumatrae1♀5MK917542MK917646異域庫蠓Culicoides peregrinus1♀4MK917543MK917647琉球庫蠓Culicoides actoni3♀4MK917539-917539MK917608-917610殘肢庫蠓Culicoides imicola2♀5MK896861,917442MK917545,917546連斑庫蠓Culicoides jacobsoni1♀4MK917538MK917607撫須庫蠓Culicoides palpifer1♂14♀4,5,7MK917477-917491MK917547-917561荒川庫蠓Culicoides arakawai9♂8♀1,3,6,7MK917494-917509MK917564-917580環(huán)斑庫蠓Culicoides circumscriptus1♂1♀2MK917492-917493MK917562,917563尖喙庫蠓Culicoides oxystoma10♀4MK917527-917537MK917597-917606霍飛庫蠓Culicoides huffi2♂14♀2,4,6,7MK917511-917527MK917581-917596似同庫蠓Culicoides similis35♀5,4,7MK917443-917477MK917622-917645
注:采集地1:居民區(qū)(康逸豪園)2:辦公區(qū)(中山海關(guān)中山六路院內(nèi))3:城中村(三溪村)4:市內(nèi)公園(紫馬嶺公園)5:城郊農(nóng)莊(一魚六味飯店,有家禽舍)6:林區(qū)(大尖山農(nóng)戶雞舍)7:城郊大學(xué)校園(獅頭山)
1.1.2主要試劑 血液和組織DNA提取試劑盒(編號(hào):Q5523)購自天根生化科技有限公司,dNTP、rTaq DNA聚合酶等購于大連寶生物有限公司,引物由Invitrogen公司合成。引物序列:
COI基因擴(kuò)增引物:
LCO1490(5′-GGTCAACAAAATCATAAA-GATATTGG-3′);
HCO2198(5′-TGATTTTTTGGTCACCCTGGAAGTTTTA-3′)[13]
Cytb基因擴(kuò)增引物:
Cytb424-449(5′-GCRTAWGCRAAWARRA-ARTAYCAYTCWGG-3′);
Cytb876-847(5′-ATYTGWCCYCAWGGWA-RWACRTAWCC-3′)[14]
1.2.1庫蠓采集 根據(jù)庫蠓的生活習(xí)性,選擇燈誘法(功夫小帥,24 W,12V,波長(zhǎng)365 nm,武漢市吉星環(huán)保科技有限責(zé)任公司)。在7種不同的生態(tài)環(huán)境中居民區(qū)(康逸豪園)、辦公區(qū)(中山海關(guān)中山六路院內(nèi))、城中村(三溪村)、市內(nèi)公園(紫馬嶺公園)、城郊農(nóng)莊(一魚六味飯店,有家禽舍)、林區(qū)(大尖山農(nóng)戶雞舍)、城郊大學(xué)校園(獅頭山)布置采樣點(diǎn)進(jìn)行蠓蟲收集,每月的上下旬各采集一次。在所選的生境內(nèi),選擇遠(yuǎn)離光源干擾和避風(fēng)的室外場(chǎng)所作為掛燈點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)掛誘蟲燈3盞,光源離地1.5 m,于日落前1 h接通電源,連續(xù)燈誘3 h后取出集蠓袋,做好標(biāo)記,蠓連同集蠓袋放置于-20℃冰箱冷凍致死。
1.2.2庫蠓基因組DNA提取 參照文獻(xiàn)的方法[15],挑選形態(tài)完整的庫蠓,切下翅置于玻片上,把剩余部分浸泡在220 μL含有1%蛋白酶K的組織消化緩沖液(天根公司DNA提取試劑盒)中,56 ℃消化過夜,按試劑盒操作說明從消化液中提取庫蠓基因組DNA,提取的DNA置于4 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3樣本處理和形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)消化后的庫蠓進(jìn)行清洗、逐步脫水、切下頭部和腹部、將頭部的觸須、觸角,腹部、足擺正后,滴上加拿大樹膠(加丁香油),重新調(diào)整擺正,封片,最后制成玻片標(biāo)本[16]。待研究庫蠓根據(jù)外部形態(tài)特征按照《中國蠓科昆蟲》[2],顯微鏡鏡檢鑒定種類,取一側(cè)翅進(jìn)行拍照。
1.2.4PCR的擴(kuò)增 分別采用COI基因和Cytb基因通用引物[13-14]進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系如下:DNA模板3 μL,上、下游引物(10 μL/L)各1 μL/L,10×PCR Buffer 5 μL,dNTP 2 μL,rTaq酶0.5 μL,加ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán),最后再72 ℃延伸10 min。
1.2.5序列測(cè)定及分析 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況,并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海立菲公司雙向測(cè)序,測(cè)序引物同擴(kuò)增引物。使用DNAMAN軟件,將去除兩端引物后的正向序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)鑒定物種。
1.2.6COI和Cytb序列分析 將庫蠓104條COI序列和Cytb序列上傳至GenBank,每條序列及其憑證標(biāo)本詳細(xì)信息見表1,并在GenBank中引入85種庫蠓656條序列長(zhǎng)度658 bp以上的COI序列和2種庫蠓234條序列長(zhǎng)度300 bp以上的Cytb序列(已剔除未明確到種和同一蠓種的序列差異>2%的序列),采用自測(cè)的臺(tái)灣蠛蠓、叢林鋏蠓、美島裸蠓、彎曲阿蠓8條COI序列和8條Cytb序列分別作為外群,使用MEGA6.0軟件將以上所得的COI序列和Cytb序列,截取出完全重合的序列進(jìn)行分析,基于Kimura2-parameter 模型,鄰接法構(gòu)建NJ樹(自檢值設(shè)置為1 000次)。
2.1主要形態(tài)特征描述 根據(jù)104只庫蠓頭部、翅、腹部、尾器的形態(tài)描述進(jìn)行檢索鑒定標(biāo)本,鑒定結(jié)果為原野庫蠓(1♀)、蘇島庫蠓(1♀)、異域庫蠓(1♀)、琉球庫蠓(3♀)、殘肢庫蠓(2♀)、連斑庫蠓(1♀)、撫須庫蠓(1♂,14♀)、荒川庫蠓(9♂,8♀)、環(huán)斑庫蠓(1♂,1♀)、尖喙庫蠓(10♀)、霍飛庫蠓(2♂,14♀)、似同庫蠓(35♀)12種庫蠓(表2、圖1)。由表2、圖1可知:1)頭部:該12種庫蠓頭部形態(tài)特征(復(fù)眼是否連接、眼面間柔毛、觸須第3節(jié)感覺器窩)之間不完全存在差異,不能作為鑒別特征。2)翅:該12種庫蠓翅特征(翅面淡、暗斑是否明顯、翅臀室淡斑數(shù)目、徑中淡斑是否覆蓋第1 徑室基部和徑中橫脈、翅面大毛所在位置、徑5 室淡斑數(shù)目、徑5 室淡斑位置)和一側(cè)翅圖之間均存在差異,可作為鑒別的特征。3)腹部:庫蠓雌蟲腹部特征(受精囊數(shù)目、受精囊形態(tài))之間不完全存在差異,可知庫蠓雌蟲腹部特征不能作為鑒別的特征。4)尾器:該12種庫蠓雄蟲尾器形態(tài)(陽莖中葉形態(tài)、陽莖中葉側(cè)突形態(tài))之間存在很大的差異,因此雄蠓可以根據(jù)其尾器形態(tài)進(jìn)行有效鑒定。
圖1 12種庫蠓一側(cè)翅圖Fig.1 Wing of Culicoides
2.2.1COI序列構(gòu)成 104只12種庫蠓COI的長(zhǎng)度均為658 bp。撫須庫蠓、環(huán)斑庫蠓、似同庫蠓、蘇島庫蠓4種庫蠓COI序列在GenBank中未找到相應(yīng)序列,為本研究首次獲得。從GenBank數(shù)據(jù)庫中引用85種庫蠓COI序列656條,采用自測(cè)的其它蠓屬COI序列有臺(tái)灣蠛蠓2條、叢林鋏蠓3條、美島裸蠓2條、彎曲阿蠓1條。將以上所得的COI序列對(duì)齊,截取出完全重合的序列后,共獲得93種庫蠓768條長(zhǎng)度為612 bpCOI序列。
2.2.2COI序列同源性比對(duì) 將本研究所獲12種庫蠓COI序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源比對(duì),原野庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、荒川庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓的COI序列相似度皆大于98%,說明該8種庫蠓的形態(tài)鑒定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的COI基因序列比對(duì)結(jié)果一致。撫須庫蠓、蘇島庫蠓在GenBank中均未收錄COI序列,而似同庫蠓、環(huán)斑庫蠓與GenBank數(shù)據(jù)庫中的COI序列相似度小于98%。
2.2.3COI聚類分析 基于COI聚類分析表明(圖2),不同種類蠓間無交叉,且相同種類蠓的不同個(gè)體均聚在同一分支下,支持率達(dá)到99%以上,僅Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]雖聚在同一分支但支持度僅90%。庫蠓屬與蠛蠓屬、鋏蠓屬、裸蠓屬、阿蠓屬混在不同支序內(nèi),但因支持度低(<20%),無法說明其親緣關(guān)系,符合關(guān)于COI基因不適合進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析的結(jié)論[18],對(duì)上述4屬并入庫蠓屬的現(xiàn)象,在其他昆蟲中也有類似的結(jié)果[19]。蘇島庫蠓與其近似種無害庫蠓序列相似度95.24%,低于98%,該兩庫蠓間無交叉,說明COI基因在不同蠓種間有明顯差異,可以用于鑒定和區(qū)分近似蠓種。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓該4種庫蠓雌蟲與其雄蟲形態(tài)特征之間存在差異,而雌蟲COI基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上,說明同一種的雌雄庫蠓之間COI基因的差異小于種間差異,可以用于雌蟲的種類鑒定。
2.3.1Cytb序列構(gòu)成 104只12種庫蠓Cytb的長(zhǎng)度均為394 bp。原野庫蠓、蘇島庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、撫須庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓、似同庫蠓10種庫蠓Cytb序列在GenBank中未找到相應(yīng)序列,為本研究首次獲得。從GenBank中引用2種庫蠓荒川庫蠓、殘肢庫蠓Cytb序列248條。采用自測(cè)的其它蠓屬Cytb序列有臺(tái)灣蠛蠓2條、叢林鋏蠓3條、美島裸蠓2條、彎曲阿蠓1條。將以上所得的Cytb序列對(duì)齊,截取出完全重合的序列后,共獲得16種庫蠓360條長(zhǎng)度321 bpCytb序列用于分析。
2.3.2Cytb序列同源性比對(duì) 將本研究12種庫蠓的全部Cytb序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源比對(duì),荒川庫蠓、殘肢庫蠓Cytb序列相似度皆大于98%,說明該2種庫蠓的形態(tài)鑒定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的Cytb基因序列比對(duì)結(jié)果一致。其余10種庫蠓原野庫蠓、蘇島庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、撫須庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓、似同庫蠓在GenBank中均未收錄有Cytb基因序列。
注:♂.雄性庫蠓序列;♀.雌性庫蠓序列;★.GenBank引用的序列。進(jìn)化樹等邊三角形?的底邊長(zhǎng)度代表每個(gè)物種含有個(gè)體數(shù)目的多少圖2 基于COI構(gòu)建的NJ樹(Kimura 2-parameter模型)Fig.2 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene COI sequence
2.3.3Cytb聚類分析 基于Cytb聚類分析表明(圖3),不同種類蠓間無交叉,且相同種類蠓的不同個(gè)體均聚在同一分支下,支持率均達(dá)到99%,說明Cytb基因在不同蠓種間有明顯差異,可以用于鑒定和區(qū)分蠓種。庫蠓屬與蠛蠓屬、鋏蠓屬、裸蠓屬、阿蠓屬混在不同支序內(nèi),但因支持度低(<10%),無法說明其親緣關(guān)系,說明Cytb不適合進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析,對(duì)上述4屬并入庫蠓屬的現(xiàn)象,與本研究COI聚類分析的研究結(jié)果一致。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓雌蟲Cytb基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上,說明同一種的雌雄庫蠓之間Cytb基因的差異小于種間的差異,可以用于雌蟲的種類鑒定。
注:♂.雄性庫蠓序列;♀.雌性庫蠓序列;★.GenBank引用的序列。進(jìn)化樹等邊三角形?的底邊長(zhǎng)度代表每個(gè)物種含有個(gè)體數(shù)目的多少圖3 基于Cytb構(gòu)建的NJ樹(Kimura 2-parameter模型)Fig.3 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene Cytb sequence
本研究在中山市不同生境采集的撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓雄蟲可以根據(jù)其尾器的形態(tài)特征進(jìn)行有效鑒定,而12種庫蠓雌蟲僅可從翅部特征的細(xì)微差異進(jìn)行鑒定和區(qū)別,特別是近似種,如蘇島庫蠓與無害庫蠓。線粒體DNA(mtDNA)具有多拷貝、分子量小、母系遺傳、突變速度適中等特點(diǎn),能準(zhǔn)確鑒別物種[22]。目前,已有多個(gè)研究表明在對(duì)蚤目、同翅目和雙翅目(搖蚊科、麻蠅科)等昆蟲進(jìn)行序列分析時(shí)聯(lián)合形態(tài)學(xué)特征以及線粒體DNA(mtDNA)綜合分析得到的結(jié)果比單獨(dú)使用線粒體COI基因分析得到的結(jié)果更為理想[23-25]。因此,本研究基于形態(tài)學(xué)特征和COI、Cytb分子標(biāo)記數(shù)據(jù)綜合分析對(duì)12種庫蠓進(jìn)行鑒定,驗(yàn)證了線粒體COI和Cytb基因序列可作為庫蠓的分類鑒定和序列聚類分析的有效分子標(biāo)記,可得到更為準(zhǔn)確的種類鑒定和序列分析結(jié)果。
庫蠓雄蟲可以根據(jù)其尾器特征進(jìn)行有效鑒定,而庫蠓雌蟲有效的形態(tài)鑒定特征極少,尤其大多近似種僅可從翅特征的細(xì)微差異進(jìn)行鑒定和區(qū)別,例如蘇島庫蠓與無害庫蠓是近似種,許多形態(tài)特征相似,只能根據(jù)翅特征進(jìn)行鑒別:蘇島庫蠓翅基淡斑大,向后延伸至臀室基部翅緣,即翅基淡斑與臀室基部淡斑融合,臀室只有2個(gè)淡斑;而無害庫蠓翅基淡斑與臀室基部淡斑分離,臀室均有3個(gè)淡斑,其余形態(tài)特征幾乎無異[15],但該2種庫蠓COI序列相似度95.24%,低于98%,說明COI基因在近似蠓種間有明顯差異,這與COI基因用于其它昆蟲近似種的研究結(jié)果相似[26-28],可以用于鑒定和區(qū)分近似蠓種,所以該12種庫蠓形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果需要分子鑒定加以補(bǔ)充。本研究組的似同庫蠓形態(tài)特征與《中國蠓科昆蟲》[2]的似同庫蠓相一致,而Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]與本研究的似同庫蠓翅特征不一致,COI序列相似度為88.18%,低于98%;Harrup鑒定的似同庫蠓[20]與本研究的似同庫蠓COI序列相似度為93.15%,低于98%,且在基于COI構(gòu)建的NJ樹中,Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]聚在同一分支的支持度僅90%,其個(gè)體間COI序列差異較大,說明Bakhoum[17]、Harrup[20]鑒定的似同庫蠓可能不準(zhǔn)確;同理,本研究組的環(huán)斑庫蠓形態(tài)特征與《中國蠓科昆蟲》[2]的環(huán)斑庫蠓相一致,而Slama D鑒定的環(huán)斑庫蠓[21]形態(tài)特征與本研究的環(huán)斑庫蠓不一致,說明Slama D鑒定的環(huán)斑庫蠓[21]可能不準(zhǔn)確,因此上傳基因序列到數(shù)據(jù)庫前,應(yīng)該盡量通過形態(tài)學(xué)的反復(fù)鑒定和確認(rèn)。在構(gòu)建的2個(gè)基因NJ樹中,雖然不同蠓屬聚在同一大支,但不同蠓種間無交叉,且相同蠓種的不同個(gè)體均聚在同一分支下,支持率達(dá)到99%以上,說明COI和Cytb基因只適于蠓蟲種級(jí)的鑒定。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓雌蟲COI基因、Cytb基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上,說明同一種的雌雄庫蠓之間COI基因、Cytb基因的差異小于種間的差異,這與COI基因、Cytb基因用于其它昆蟲的研究結(jié)果相似[29-32],可以用于雌蟲的種類鑒定。
線粒體COI基因和Cytb基因分子標(biāo)記已應(yīng)用于多種醫(yī)學(xué)昆蟲近似種的鑒定與區(qū)別[26-28],由于分子標(biāo)記不受性別、早期階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)、肢體殘缺的蟲體、鑒定者專業(yè)性的的影響[33],形態(tài)學(xué)與分子學(xué)相結(jié)合的方法鑒別庫蠓,可以相互驗(yàn)證,使結(jié)果更為準(zhǔn)確,為庫蠓的鑒別提供了準(zhǔn)確高效的方法。
利益沖突:無