王婧 孫志雯 陳海峰 陳曉蘭

摘要：豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可感染各階段的豬，使患病動(dòng)物出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐，并伴隨厭食和精神沉郁等臨床癥狀，對(duì)哺乳仔豬危害尤為嚴(yán)重。為了解河南某豬場(chǎng)PEDV流行毒株S1基因的變異情況，以江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的感染PEDV臨床病料為樣本，對(duì)其進(jìn)行S1基因擴(kuò)增、克隆以及序列分析。對(duì)S1基因的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該豬場(chǎng)PEDV分離株S1基因推導(dǎo)的氨基酸序列之間的同源性高達(dá)99%，BLAST搜索結(jié)果顯示與AHCZ-2株的相似性最高，將獲得序列與經(jīng)典毒株CV777相比在第57位插入了4個(gè)氨基酸NQGV，在第134位插入1個(gè)氨基酸D，而在第157、158位缺失2個(gè)氨基酸，在中和表位區(qū)域共有11處氨基酸突變，與國(guó)內(nèi)其他毒株均位于G2-b進(jìn)化分支，研究結(jié)果為進(jìn)一步掌握該地PEDV的流行毒株和毒力變異情況提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;S1基因;遺傳進(jìn)化

中圖分類號(hào)： S855.3?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0099-04

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）以急性腸炎為特征，在仔豬常由于致死性水樣腹瀉導(dǎo)致脫水死亡的高致死率疾病[1]。病原為豬流行性腹瀉病毒（PEDV），該病毒可感染各階段的豬，使患病動(dòng)物出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐，并伴隨厭食和精神沉郁等臨床癥狀。仔豬的感染率可達(dá)100%，而母豬則不一定[2]。腹瀉時(shí)的排泄物可在48 h內(nèi)檢測(cè)到PEDV病毒，甚至有時(shí)可延長(zhǎng)至4周。PEDV可感染1周齡以內(nèi)仔豬，引起嚴(yán)重水泄和3～4 d嘔吐，隨后出現(xiàn)嚴(yán)重脫水和電解質(zhì)失衡而造成死亡，平均死亡率可達(dá)到50%，在1～3日齡仔豬死亡率甚至可達(dá)到100%，然后降低至10%。雖年齡大一點(diǎn)的豬比1周齡以內(nèi)的仔豬初發(fā)時(shí)發(fā)病更輕，然而PEDV影響育肥豬的生長(zhǎng)。母豬可能不會(huì)腹瀉，但是通常會(huì)顯示抑郁和厭食[3]。

PEDV是一個(gè)大的有囊膜RNA病毒，屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）成員，其基因組共約28 kb，擁有5′端非翻譯區(qū)和3′端非翻譯區(qū)，共編碼至少7個(gè)開放閱讀框（ORF1a，ORF1b，ORF2～6）其中ORF1a和ORF1b共占了整個(gè)基因組5′端2/3用于編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。剩余的3′端的基因共編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別是纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）。其中S蛋白是病毒子包膜主要的envelope Ⅰ型糖蛋白，與病毒入侵以及刺激并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體密切相關(guān)。S蛋白可劃分為S1（1～735 aa）和S2（736～1383 aa）2個(gè)結(jié)構(gòu)域，蛋白S1結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R(shí)別pAPN受體至關(guān)重要。PEDV進(jìn)入細(xì)胞始于與pAPN結(jié)合，隨后通過直接膜融合的方式與靶細(xì)胞完成內(nèi)化的過程，隨后并脫殼釋放病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)開始復(fù)制[4-6]。

另有研究表明，冠狀病毒S蛋白的變異將會(huì)導(dǎo)致其宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)基毒力發(fā)生改變。其中存在較高變異性的主要是S1基因，不同分離株S1基因間存在不同程度的核苷酸插入、突變和刪減等現(xiàn)象，進(jìn)而改變病毒原始抗原特性，因此常被用來研究不同時(shí)間和地區(qū)流行毒株的親緣關(guān)系[7]。

本研究于2017年12月至2018年3月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開展，主要對(duì)該實(shí)驗(yàn)室保存的豬流行性腹瀉病料進(jìn)行S1基因克隆，并運(yùn)用DNAMAN、MEGA等基因分析軟件進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步掌握PEDV的流行毒株和毒力變異情況提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品的采集

試驗(yàn)用病料為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的感染流行性腹瀉病毒仔豬腸道樣品。

1.2?試劑

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）一步法RT-PCR試劑盒、EX Taq酶、Marker DL 2000、Marker DL 5000、pMD18-T載體等，均購(gòu)自TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司;普通質(zhì)粒提取，購(gòu)自天根生化科技有限公司;瓊脂糖，購(gòu)自西班牙Biowest公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3?樣品處理及RNA提取

取保存病料的小腸組織加入適量液氮進(jìn)行研磨稀釋后，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。吸取離心后上清液按照Trizol試劑提取RNA的操作步驟進(jìn)行，最后將RNA溶解至DEPC水溶液中，于-20 ℃保存。

1.4?引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)CV777毒株S基因序列作為參考，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列為：S1-F：5′-GCTTGTTGAAGAATGGTAAGTTGC-3′;S1-R：5′-AGCCTGCTCTGAAAAAGAACAT-3′，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物合成。

1.5?反轉(zhuǎn)錄及基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)試劑盒操作說明，配制RT-PCR反應(yīng)液，將一步法酶混合物、Buffer、引物、提取的PEDV總RNA及RNase Free dH2O配制成25 μL反應(yīng)體系，按照以下程序放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min，反應(yīng)結(jié)束后吸取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.6?S1基因的克隆

電泳檢測(cè)條帶和目的條帶一致后，吸取PCR反應(yīng)混合液3 μL，pMD-18T載體1 μL，Buffer 5 μL，滅菌水1 μL，混合均勻后置于16 ℃連接2 h，并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，采用PCR法進(jìn)行鑒定，鑒定成功后將陽(yáng)性菌株送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7?序列分析

將測(cè)序得到序列采用DNA MAN軟件進(jìn)行翻譯。對(duì)翻譯推導(dǎo)所得的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTp分析、并與經(jīng)典毒株CV777序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并分析其突變位點(diǎn)。最后與近年國(guó)內(nèi)外流行的毒株進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Mega軟件進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，選擇毒株信息見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?PEDV S1基因的擴(kuò)增及克隆

將提取的PEDV RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示目的條帶約2 188 bp，將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，采用PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的克隆菌株送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2?PEDV S1基因的序列分析

通過測(cè)序得到3條S1序列，分別命名為CH/HNZK1、CH/HNZK2、CH/HNZK3，長(zhǎng)度均為2 188 bp，共編碼約720個(gè)氨基酸，3株P(guān)EDV分離株S1基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列相似性為99%。對(duì)3條S1基因核酸序列進(jìn)行BLAST搜索，結(jié)果均與AHCZ-2株的相似性最高，高達(dá)99%。

將推導(dǎo)氨基酸序列與經(jīng)典毒株CV777相比，在第57位插入了4個(gè)氨基酸NQGV，在第134位插入1個(gè)氨基酸D，而在第157、158位缺失2個(gè)氨基酸，與王飛等報(bào)道的我國(guó)部分地區(qū)PEDV S基因的蛋白序列[8]相似。進(jìn)一步采用Clustal Omega在線軟件對(duì)所得3個(gè)S1基因推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列和經(jīng)典毒株CV777的序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在中和表位區(qū)域（499～638 aa）共有11處突變，分別是517位A→S，521位 L→R，523位S→G，527位V→I，542位D→G，549位T→S，594位G→S，605位A→E，619位F→S，621位K→T，635位 I→V。而在預(yù)測(cè)的2處受體結(jié)合域（25～88aa、249～529 aa）分別有10處以上氨基酸突變或插入和缺失。具體突變氨基酸位點(diǎn)見表2。

2.3?PEDV S1蛋白遺傳進(jìn)化分析

主要選擇PEDV經(jīng)典毒株CV777，中國(guó)周邊各國(guó)的疫苗株、經(jīng)典流行株，及近年來在我國(guó)境內(nèi)分離到的部分毒株與本試驗(yàn)克隆所得到的3株P(guān)EDV毒株S1基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 5軟件，N-J法進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。

利用篩選得到的共50株代表毒株及本研究獲得的S1蛋白氨基酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，可見進(jìn)化樹可分為G1和G2 2個(gè)大分支，每分支可劃分為a、b 2小分支，本次試驗(yàn)所得3株S1蛋白均位于G2-b分支，位于同一分支的還有中國(guó)境內(nèi)YC2014、CH/GDZH02/1、CH-SCAY-2014、HBXY-1、CH-QTC-01-2015和美國(guó)流行株USA/Colorado、CHGD-01，提示與本次分離毒株關(guān)系較近。韓國(guó)經(jīng)典毒株Chinju99、NJ02、KNU-0801和日本的KH野豬毒株均位于G2-a分支。美國(guó)流行的經(jīng)典株CV777以及LZC、DR13、Brl/87等均位于G1-a分支，CH/JLGZL/2011、JS-2004-2位于G1-b分支，而與喬涵等報(bào)道的河南分離株均位于G2[9]分支相似。

3?討論

PEDV于1982年日本首次報(bào)道后便在亞洲各國(guó)迅速流行。2000年以后，PEDV在菲律賓、泰國(guó)、越南和我國(guó)臺(tái)灣等地報(bào)道日益增加[10-11]。在90年代早期，經(jīng)典毒株CV777的滅活苗在中國(guó)廣泛被應(yīng)用，直到2010年P(guān)ED只有少數(shù)暴發(fā)[12]。但是，在2010后期PED的流行在養(yǎng)豬大省死灰復(fù)燃，我國(guó)科學(xué)家對(duì)這段時(shí)間PEDV的分子流行病學(xué)進(jìn)行了大量調(diào)查。從2011年2月至2014年3月，我國(guó)進(jìn)行了除西藏、海南和港、澳、臺(tái)的29省的大規(guī)模調(diào)查。樣品陽(yáng)性率從61.1%到78.49%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率在71.43%～83.47%[13]。

2017年3月在河南周口某豬場(chǎng)出現(xiàn)大量哺乳仔豬腹瀉，通過對(duì)仔豬腸道樣品進(jìn)行PCR以及血清ELISA檢測(cè)確定本次為PEDV感染。由于RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒容易發(fā)生變異[3]。PEDV的S基因?yàn)槔w突蛋白基因，是結(jié)構(gòu)蛋白中最大的基因，是主要的免疫蛋白基因，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。而S基因可變區(qū)主要集中在S1區(qū)（1～735 aa），因此通常分析S1蛋白的序列變化情況來研究PEDV的遺傳進(jìn)化關(guān)系。本研究對(duì)采集的樣品進(jìn)行了S1基因的擴(kuò)增和進(jìn)化分析，結(jié)果顯示3份樣品的S基因與疫苗株CV777相比相似性在99%，雖然表現(xiàn)出極高的相似性，但是這3株新分離毒株相對(duì)經(jīng)典疫苗株在中和表位區(qū)域（499～638 aa）[14]共有11處氨基酸突變，有研究報(bào)道在該結(jié)構(gòu)域氨基酸突變易影響S蛋白的疏水性[15]。尤其值得注意的是被檢毒株S1蛋白中和表位區(qū)域的549位T→S、594位G→S突變現(xiàn)象，549位和594位為S蛋白的中和表位結(jié)構(gòu)域，這些位置的突變可能和免疫動(dòng)物發(fā)病具有重要聯(lián)系，我國(guó)自2011年后分離的PEDV這2處均突變?yōu)榻z氨酸，而與2002—2009年期間分離到的PEDV毒株2處的突變情況差異較大[16]。

在2010年后的這些年，屬于G1-b基因群的新的變異毒株在中國(guó)被首次報(bào)道。另外，免疫動(dòng)物的PED暴發(fā)使CV777毒株疫苗的保護(hù)性產(chǎn)生了質(zhì)疑。至此，PEDV在中國(guó)的不同地區(qū)流行被陸續(xù)報(bào)道。目前，中國(guó)PED暴發(fā)主要是由于G1b變異株和與CV777不同基因型的G2流行野毒[17]。對(duì)此次分析的3株P(guān)EDV病毒進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示均屬于G2-b分支，從親緣關(guān)系看與在河南省附近其他省份分離到的PEDV毒株親緣關(guān)系較近。這與周兵強(qiáng)等分析的M基因和ORF3基因結(jié)果[18]一致，與經(jīng)典毒株以及疫苗株均發(fā)生了變異，而與2010年后國(guó)內(nèi)流行的大多數(shù)毒株的同源性較高。本研究對(duì)進(jìn)一步跟蹤監(jiān)測(cè)河南省PEDV分子流行特征，以及制定綜合防控措施和新疫苗的研發(fā)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lee D K，Park C K，Kim S H，et al. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]. Virus Research，2010，149（2）：175-182.

[2]Lee C. Porcine epidemic diarrhea virus：an emerging and re-emerging epizootic swine virus[J]. Virology Journal，2015，12（1）：193.

[3]Alvarez J，Sarradell J，Morrison R，et al. Impact of porcine epidemic diarrhea on performance of growing pigs[J]. PLoS One，2015，10（3）：e0120532.

[4]Kocherhans R，Bridgen A，Ackermann M，et al. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus （PEDV） genome sequence[J]. Virus Genes，2001，23（2）：137-144.

[5]Bridgen A，Kocherhans R，Tobler K，et al. Further analysis of the genome of porcine epidemic diarrhoea virus[J]. Advances in Experimental Medicine & Biology，1998，440：781.

[6]Song D，Park B. Porcine epidemic diarrhoea virus：a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines[J]. Virus Genes，2012，44（2）：167-175.

[7]劉艷成，蘆?婷，劉丹丹，等. 2010—2014年豬流行性腹瀉病毒S基因遺傳進(jìn)化分析[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015（8）：28-34.

[8]王?飛，陳小芬，蘇丹萍，等. 2014—2015年我國(guó)部分省份豬流行性腹瀉病毒S基因的遺傳變異分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（9）：1484-1488.

[9]喬?涵，李?輝，趙?麗，等. 豬流行性腹瀉病毒河南流行株S基因的克隆與遺傳進(jìn)化分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，37（5）：781-786.

[10]Fan B C，Jiao D，Zhao X N，et al. Characterization of Chinese porcine epidemic diarrhea virus with novel insertions and deletions in genome[J]. Scientific Reports，2017，7：44209.

[11]Lin C M，Saif L J，Marthaler D，et al. Evolution，antigenicity and pathogenicity of global porcine epidemic diarrhea virus strains[J]. Virus Research，2016，226（SI）：20-39.

[12]Wang D，F(xiàn)ang L，Xiao S. Porcine epidemic diarrhea in China[J]. Virus Research，2016，226：7-13.

[13]Sun D，Wang X，Shan W，et al. Epidemiology and vaccine of porcine epidemic diarrhea virus in China：a mini-review，[J]. Journal of Veterinary Medical Science，2016，78（3）：355-363.

[14]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Molecules and Cells，2002，14（2）：295-299.

[15]Sun R Q，Cai R J，Chen Y Q，et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2012，18（1）：161-163.

[16]Song D，Moon H，Kang B. Porcine epidemic diarrhea：a review of current epidemiology and available vaccines[J]. Clinical and Experimental Vaccine Research，2015，4（2）：166-176.

[17]Li W T，Li H，Liu Y B，et al. New variants of porcine epidemic diarrhea virus，China，2011[J]. Emerging Infectious Diseases，2012，18（8）：1350-1353.

[18]周兵強(qiáng)，吳志明，閆若潛，等. 2012—2014年河南省豬流行性腹瀉病毒M基因和ORF3基因的遺傳變異分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2014（12）：1236-1243.