俞發(fā)榮, 李建軍, YU Xin, 連秀珍, 謝明仁,*, 李登樓

不飽和脂肪酸對人胃癌細胞PI3K-Akt信號通路中相關(guān)基因表達的影響

俞發(fā)榮1, 李建軍1, YU Xin2, 連秀珍1, 謝明仁1,*, 李登樓1

1. 甘肅政法大學 甘肅省證據(jù)科學技術(shù)研究與應用重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, US

為了探索不飽和脂肪酸(USFA)對人胃癌細胞PI3K-Akt信號通路中相關(guān)基因表達的影響, 取2×106個·L-1胃癌細胞接種于96孔培養(yǎng)板, 3個濃度給藥組: 分別加0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA每孔10 μL; 5-FU組: 每孔加10 mg·L-15-FU 10 μL; 對照組: 每孔加二甲基亞砜(30 μL·L-1)10 μL。置于37℃、5%CO2的飽和濕度條件中培養(yǎng)48 h。用流式細胞儀檢測USFA對人胃癌細胞凋亡率; 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測胃癌細胞中粘著斑激酶(FAK)、蛋白激酶(Akt)表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 給予人胃癌細胞0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA培養(yǎng)48 h, 細胞凋亡率分別為17.42%, 23.23%, 26.24% (<0.05,<0.01); FAK和Akt水平比對照組分別降低10.91%, 47.28%, 64.36% 和17.33%, 34.96%, 54.39%(<0.05,<0.01)。結(jié)果表明, USFA對人胃癌細胞增殖的抑制作用與抑制細胞分裂周期、下調(diào)PI3K-Akt信號通路中FAK、Akt水平有關(guān)。

不飽和脂肪酸; 人胃癌細胞; 細胞分裂周期; 凋亡; PI3K-Akt信號通路

0 前言

近年來, 隨著脂肪酸研究的不斷深入, 人們認識到不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養(yǎng)物質(zhì)[1], 其對于維持人體健康[2]、提高腫瘤患者的免疫功能[3]、改善營養(yǎng)狀態(tài)[4]起著重要的促進作用。其中某些不飽和脂肪酸具有明顯的細胞毒性和抗腫瘤作用[5, 6]。研究表明, 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有主要關(guān)系。PI3K-Akt信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的分裂、生存。PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路被激活時, 促進細胞增殖[7], 被抑制時, 加速細胞凋亡, 起到抑制細胞增殖效應[8]。體外實驗發(fā)現(xiàn), 給予人胃癌細胞不飽和脂肪酸, 細胞PKB/Akt水平隨給藥劑量的增加而降低[9]。將十八烯酸給予荷人胃癌組織的SCID小鼠, 移植瘤P13K水平隨給藥劑量增加而降低[10]。PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路又受局部粘著斑激酶(FAK)調(diào)控, 這對研究腫瘤細胞增殖的調(diào)控機制提供了一條新的線索。

據(jù)文獻報道, 甘肅省腫瘤發(fā)病率已經(jīng)達到240人每10萬人, 其中胃癌發(fā)病率和死亡率一直居高不下,嚴重影響著地方經(jīng)濟的發(fā)展與人們的身心健康。為了尋找預防和治療胃癌的天然藥物, 減輕藥物對病人的毒副作用,本文選用從甘肅貓兒眼()塊根中提取分離出的不飽和脂肪酸(USFA), 給予人胃癌細胞, 探討FAK基因在人胃癌細胞PI3K-Akt信號通路中的調(diào)控作用, 為腫瘤的預防和治療尋找新的藥物資源提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細胞(甘肅省醫(yī)學科學研究院), 不飽和脂肪酸(USFA, 蘭州大學化工學院天然植物研究所), 胎牛血清(鄭州九龍生物制品有限公司), 5-氟尿嘧啶 (5-FU, 上海曙燦實業(yè)有限公司), 二甲基亞砜(DMSO, 天津光復精細化工研究所), FAK、Akt試劑盒(北京索寶生物科技有限公司), 3552-2型全自動高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱(SHELDON MFG INC.), 酶標儀, MULTISKAN 3(Thermo), 超凈工作臺(上海智城有限公司), 奧林巴斯數(shù)碼顯微鏡(Olympus(中國)有限公司), 流式細胞儀(USA)。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌細胞培養(yǎng)

取人胃癌細胞用含10%的胎牛血清、2 mmol·L–1谷氨酰胺、1×105U·L–1青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液, 在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測USFA對人胃癌細胞基因表達的水平

取人胃癌細胞液(含2×106個·L–1細胞), 加入96孔板, 每孔90 μL。給藥組分為低劑量組(L): 每孔加入0.2 mg·L–1USFA(用DMSO助溶加RPMI1640培養(yǎng)液配制, DMSO含量≤30 μL·L–1, 其余同) 10 μL; 中劑量組(M): 每孔加入0.8 mg·L–1USFA 10 μL; 高劑量組(H): 每孔加入1.6 mg·L–1USFA 10 μL; 5- FU組: 每孔加5-FU(10 mg·L–1)10 μL; 對照組(C): 每孔加DMSO(30 μL·L–1)10 μL。5%CO2, 37 ℃, 飽和濕度條件中培養(yǎng)48 h,用酶標儀在450 nm處測檢測各組細胞吸光度(OD), ELISA法測FAK、Akt表達水平。

1.2.3 流式細胞儀檢測USFA對人胃癌細胞分裂周期的影響

取人胃癌細胞液2 mL, 加入含RPMI1640液6 mL的培養(yǎng)瓶, 給藥組分別加入USFA 0.2,0.8,1.6 mg·L–1和5-Fu各0.8 mL; 對照組加DMSO(30 μL·L–1)0.8 mL, 培養(yǎng)48 h, 離心收集細胞, 用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 直線回歸方程制作

以FAK、Akt標準品的濃度為橫坐標, 吸光度(OD)為縱坐標作出標準曲線的直線回歸方程。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計, 組間差異用單因素方差進行分析,<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌細胞凋亡率

流式細胞儀檢測, 低、中、高3個濃度實驗組人胃癌細胞凋亡率與給藥濃度呈正相關(guān); 高劑量給藥組細胞凋亡率比5-FU組升高18.59%(<0.05), 低、中劑量組細胞抑制率與5-FU組接近。

表1 人胃癌細胞的凋亡率

注： L-USFA 0.2 mg·L–1; M-USFA 0.8 mg·L–1; H-USFA 1.6 mg·L–1; 5-FU-10 mg·L–1; C-DMSO 10 μL; 下同。

2.2 人胃癌細胞FAK表達水平

FAK直線回歸方程:=1.5×10–2+1.1×10-2,2=0.9994。將各組細胞吸光度(OD)代入方程, 低、中、高濃度實驗組和5-FU組的FAK水平分別為81.67±0.41, 48.33±0.19, 32.67±0.18和54.1±0.33, 比對照組FAK水平(91.67±0.22)分別降低了32.72%、47.28%、64.36%和41.08%,差異有統(tǒng)計學意義(=6.02,<0.01)見圖1。

2.3 人胃癌細胞Akt表達水平

Akt直線回歸方程: Y=1.19×10–2x+2.32×10-2, R2=0.9996。將各組細胞吸光度(OD)代入方程, 低、中、高濃度實驗組和5-FU組的Akt水平分別為72.61±0.22, 57.06±0.45, 40.25±0.53和58.74±0.22, 比對照組Akt水平(87.73±0.36)分別降低了28.63%、34.96%、54.39%和33.21%, 差異有統(tǒng)計學意義(=8.934,<0.01)見圖2。

圖1 人胃癌細胞FAK表達的水平(與C組比: **P<0.01)

Figure 1 FAK expression level in human gastric cancer cells (**<0.01C group)

圖2 人胃癌細胞Akt表達水平(與C組比: **P<0.01)

Figure 2 Akt expression level in human gastric cancer cells (**<0.01C group)

3 討論

流行病學研究發(fā)現(xiàn), 不飽和脂肪酸(USFA)具有改善腫瘤患者術(shù)后營養(yǎng)狀態(tài)[11],降低腫瘤發(fā)病率[12], 抑制腫瘤生長[13]、誘導細胞凋亡[14]的作用。其通過影響脂質(zhì)代謝調(diào)控基因的表達[15],增強免疫功能, 提高抗感染、抗腫瘤能力[16]。郭佳鈺等[17]報道, USFA通過改變腫瘤細胞膜結(jié)構(gòu)、損傷細胞內(nèi)線粒體, 導致腫瘤細胞凋亡, 抑制PKB/Akt活性[9]。將十二碳烯酸給予人神經(jīng)膠質(zhì)細胞(H4)[18], G0G1期細胞數(shù)比對照組明顯增加, G2M期細胞顯著減少, 起到抑制細胞分裂增殖和促進細胞凋亡的作用。Corti等報道[19], 腫瘤生長或抑制受磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的調(diào)節(jié)和控制[20]。PI3K-AKT信號通路活性發(fā)生變化, 不僅能引起細胞惡性轉(zhuǎn)化,在腫瘤血管生成和細胞生長,增殖,新陳代謝、遷移、分化和凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用[21]。粘著斑激酶(FAK)[22]、PI3K[23]在腫瘤組織中的表達強度高于正常組織, 其對細胞生存[24]、粘著、游走過程中起著至關(guān)重要的作用[25]。CAO Weiguo等[26]研究發(fā)現(xiàn), PI3K/Akt信號通路被激活時, 促進腫瘤細胞增殖。LI Jiyou等[27]報道, FAK活性增強時, 細胞分裂、侵染能力增加, 細胞凋亡率降低[28]。Vengatesen[29]給予FAK抑制劑, FAK表達水平降低, 細胞分裂過程被抑制, G0/G1期、G2/M期細胞比率增加, S期細胞比率下降, 進入分裂期細胞減少, 起到抑制細胞分裂的作用。本研究給予腫瘤細胞不飽和脂肪酸(USFA)處理后, 細胞中PI3K、p53基因表達下調(diào)[10], MDM2、p21基因表達明顯上調(diào)[9], FAK和Akt水平顯著下降, 細胞凋亡率隨給藥劑量的增加而升高, 其中G0/G1、S期細胞比例增加, G2/M細胞比例明顯減少, 進入分裂期的細胞減少, 細胞分裂增殖被抑制。實驗結(jié)果與以上學者報道結(jié)果一致。實驗結(jié)果表明, USFA抑制人胃癌細胞增殖, 與下調(diào)PI3K-Akt信號通路中FAK、Akt水平、抑制人胃癌細胞分裂周期有關(guān)。

本研究將甘肅貓兒眼(甘遂)提取分離出不飽和脂肪酸并對人胃癌細胞增殖抑制作用以及對PI3K-Akt信號通路中相關(guān)基因表達的影響進行了實驗研究, 不僅為預防和治療腫瘤提供了新的藥物資源, 而且為進一步研究不飽和脂肪酸抗腫瘤作用的機制積累了資料。

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Effects of unsaturated fatty acid on the expression of related genes in PI3K-Akt signaling pathway of human gastric cancer cells

YU Farong1, LI Jianjun1, YU Xin2, LIAN Xiuzhen1, XIE Mingren1,*, LI Denglou1

1. Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China; 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, US

In order to study the effects of USFA on the expression of related genes in PI3K-Akt signaling pathway in human gastric cancer cells, 2×106cell·L-1human gastric cancer cells were inoculated into 96-well culture plates, each with 90 μL. Three concentration groups: 0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA 10 μL, 5-FU group: 10 mg·L-15-FU 10 μL, control group: DSMO(30 μL·L-1)10 μL for each hole were set up at 37℃ and 5% CO2saturated humidity conditions in 48 h. The apoptosis rate of human gastric cancer cells was measured by flow cytometry. Focal adhesion kinase (FAK) and Akt expressions in gastric cancer cells were detected by ELISA. The results showed that the apoptosis rates of human gastric cancer cells were 17.42%, 23.23% and 26.24% after being cultured for 48 h with 0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA, compared with the control group(<0.05,<0.01). The levels of FAK and Akt were decreased by 10.91%, 47.28%, 64.36% and 17.33%, 34.96%, 54.39%, respectively, compared with the control group(<0.05,<0.01). The results showed that the USFA had obvious inhibitory effect on the proliferation of human gastric cancer cells, and its mechanism was related to the inhibiting cell division cycle of human gastric cancer cells and down-regulating levels of FAK and Akt in the PI3K-Akt signaling pathway.

unsaturated fatty acid; human gastric cancer cells; cell division cycle; apoptosis; PI3K-Akt signaling pathway

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.06.009

R961.1

A

1008-8873(2019)06-060-04

2019-06-03;

2019-08-08

甘肅省自然科學基金項目(17JR5RA158); 甘肅省高校科技創(chuàng)新團隊項目(2016C-09); 蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(2016-RC-85); 蘭州市科技計劃項目(2018-1-17; 2019-1-48); 西北民族地區(qū)偵查理論與實務研究中心基金資助項目; 甘肅省證據(jù)科學特色學科項目

俞發(fā)榮(1959—), 男, 博士, 研究員, 主要從事生物與環(huán)境、藥理學、毒理學以及實驗動物學研究, E-mail: tim9898@163.com

謝明仁, 男, 碩士, 副教授主要從事法醫(yī)生物學教學與研究, E-mail: xmr6700@gsli.edu.cn

俞發(fā)榮,李建軍,YU Xin, 等. 不飽和脂肪酸對人胃癌細胞PI3K-Akt信號通路中相關(guān)基因表達的影響[J]. 生態(tài)科學, 2019, 38(6): 60-63.

YU Farong, LI Jianjun, YU Xin, et al. Effects of unsaturated fatty acid on the expression of related genes in PI3K-Akt signaling pathway of human gastric cancer cells[J]. Ecological Science, 2019, 38(6): 60-63.