趙志鵬,李曉晨，李潤青，楊曉歡，趙秀英

(清華大學附屬北京清華長庚醫(yī)院 檢驗醫(yī)學科，北京102218)

金黃色葡萄球菌(Sau)是自然界中分布最廣的細菌之一，可引起多種組織、器官感染，是重要的致病菌之一，但一般認為Sau不是腹瀉的直接致病菌。在尋找腹瀉的病原學證據(jù)中，常規(guī)便培養(yǎng)僅限于沙門金屬、志賀菌屬的分離培養(yǎng)，Sau往往被忽視。本研究分析了本院近3年兒童糞便標本中Sau的檢出情況，分別對比成人腹瀉糞便標本檢出情況、并且對全部Sau菌進行腸毒素(SEs)檢測，發(fā)現(xiàn)兒科糞便標本的Sau檢出率遠高于成人，進一步對兒科糞便標本分離出的Sau進行了SEs和ses檢測，發(fā)現(xiàn)這些Sau具有高表達SEs和高攜帶ses的特點，因此兒童腹瀉病人中Sau應該引起足夠重視。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月到2018年8月來北京清華長庚醫(yī)院門、急診就診的腹瀉病人并且進行糞便培養(yǎng)的病例總共2017例(其中成人1682例，兒童335例)，對兒童腹瀉病人糞便標本中分離出的Sau進行腸毒素研究。

1.2 細菌培養(yǎng)與鑒定

糞便標本接種于血平板、SS平板或慶大平板(梅里埃)，可疑菌落使用全自動微生物分析儀(梅里埃VITEK-Ⅱ Compact)進行鑒定和藥敏。培養(yǎng)結果按照弧菌屬、單胞菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、難辨梭菌、金黃色葡萄球菌、其他菌屬進行分類統(tǒng)計。

1.3 腸毒素檢測

使用酶聯(lián)免疫熒光法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素(SEs)(梅里埃mini-VlDAS 免疫分析儀)。分離菌株接種于Thio液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h離心，取上清用于SEs檢測，按照試劑說明書所標注，結果≥0.13判斷為陽性，<0.13判斷為陰性。

1.4 PCR法檢測毒素基因

PCR法檢測SEA-SEE五種最常見腸毒素的基因。94℃預處理5 min，94℃變性2 min,57℃退火2 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)[1]。引物序列見表1。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 腸毒素引物序列[1]

2 結果

2.1 兒童和成人檢出菌種分析

兒童腹瀉標本335例，細菌培養(yǎng)檢出Sau 17例(5.07%)、沙門菌屬14例(3.58%)和假單胞菌菌屬5例(1.49%)。成人腹瀉標本1682例，細菌培養(yǎng)檢出弧菌屬116例(6.90%)、單胞菌屬28例(1.66%)、沙門菌屬25例(1.49%)、志賀菌屬7例(0.42%)、難辨梭菌5例(0.30%)、金黃色葡萄球菌3例(0.18%)和其他21例(1.25%),如表2。

表2 兒童及成人 門急診腹瀉患者便培養(yǎng)結果

2.2 兒童腹瀉標本Sau產(chǎn)腸毒素結果

17例兒童糞便標本中分離的Sau有10例(58.85%)腸毒素檢測陽性，7例(41.18%)腸毒素檢測陰性，兒童腹瀉標本Sau產(chǎn)腸毒素率為58.85%。

2.3 兒童腹瀉標本Sau腸毒素基因檢測結果

17例兒童糞便標本中分離的Sau樣本中10例攜帶腸毒素基因，其中一例同時攜帶sec和sed,一例同時攜帶seb和see，一例毒素陽性而基因檢測陰性，兩例毒素陰性而基因檢測陽性，腸毒素基因攜帶和腸毒素表達情況見表3。

表3 腸毒素基因和毒素表達檢測匯總表

3 討論

腸道菌群的復雜性決定了感染性腹瀉病人尋找病原學證據(jù)的困難性， Sau是環(huán)境中存在較為廣泛的細菌之一，Johns Hopkins School的一項研究顯示在抽檢的24間臥室的塵土中12間培養(yǎng)出了Sau(50%)，應用定量PCR技術檢出率更高[2]。加利福尼亞51963份生牛奶樣本中Sau檢出率為25.3%[3]，在伊拉克食物處理者的鼻咽部30.1%能夠分離出Sau，其中38%為產(chǎn)腸毒素株[4]。在我國Sau產(chǎn)生腸毒素污染食物也較常見[5-7]，尤其牛奶及奶制品，中國黑龍江省400份兒生牛奶樣本中Sau檢出率高達83.5%[8],Sau與腹瀉的關系研究最受重視的兩個方面是抗生素相關性偽膜性腸炎和食物中毒性腹瀉，而門急診腹瀉病人Sau檢測一般不作為常規(guī)篩查項目。

本研究發(fā)現(xiàn)兒童腹瀉病人糞便標本中檢出的病原譜與成人有顯著差異，成人以弧菌屬、單胞菌屬檢出率較高，而兒童則以 Sau檢出率最高。王芳健[9]分析山東地區(qū)嬰幼兒腹瀉病例Sau占全部檢出病原菌的5.1%，嚴銀燕[10]等對浙江省腹瀉兒童病原學分析指出Sau占全部檢出病原菌的23.4%。分析原因，成人和兒童的飲食譜存在差異，兒童有更多機會攝入奶、奶制品、蛋類、肉罐頭等，而這些食物是常見的易被Sau或其毒素污染的食物，本實驗室觀察的17例Sau培養(yǎng)陽性的兒童有12人為3歲到4歲，此年齡段兒童正是攝入此類食品較多的年齡段，且此年齡段兒童從母體獲得的免疫力已經(jīng)降低，自身免疫力又未充分建立，這可能是此年齡段兒童Sau感染引起腹瀉高發(fā)的原因。環(huán)境中的Sau耐藥率與糞便分離Sau耐藥率一致也間接證明了糞便中的Sau來源于環(huán)境的可能性大。

Sau引起腹瀉的毒力因子為腸毒素(SEs)，將有明確致嘔吐作用的命名為腸毒素(SEs)，沒有或致嘔吐作用尚有待確證的命名為腸毒素樣毒力因子(SEls),目前發(fā)現(xiàn)的SEs和SEls有二十一種。本研究研究了SEa-SEe五種最常見的腸毒素，發(fā)現(xiàn)經(jīng)糞便培養(yǎng)出的sau產(chǎn)腸毒素率為58.85%，與汪永祿等[11]報道的產(chǎn)腸毒素率為50%接近。

綜上，嬰幼兒腹瀉患者中Sau培養(yǎng)陽性率高，且分離得到的菌株產(chǎn)腸毒素率高，因此對于嬰幼兒的腹瀉病例建議便培養(yǎng)時增加對Sau的篩查，直接檢測糞便中的腸毒素也是提高腹瀉患者病因精準診斷的方法和保障。但本研究研究例數(shù)較少，而且缺乏環(huán)境(母親、輔食、居住環(huán)境)中Sau的研究，因此對sau的感染途徑尚需要進一步研究和探討。