馬業(yè)菲，付小芬，朱辰暉，高雪娜，滑瑩瑩，葛英利，劉海洋

(齊魯理工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200)

無(wú)機(jī)焦磷酸根(PPi)離子是腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)及其它核苷酸的水解產(chǎn)物，在生物體系中充當(dāng)著非常重要的角色。研究表明，PPi能夠參與許多生命過(guò)程中的能量傳遞以及新陳代謝[1]。PPi還可作為潛在的生物標(biāo)記物應(yīng)用于癌癥等疾病的早期診斷和治療[2]。PPi在生物體系和醫(yī)學(xué)分析中占據(jù)著相當(dāng)重要的地位。因此，建立快速、準(zhǔn)確測(cè)定PPi的方法具有十分重要的意義。

在多種分析方法中，分光光度法具有簡(jiǎn)單，快速，無(wú)需昂貴的儀器，可進(jìn)行目視化檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。根據(jù)文獻(xiàn)里可知[3-4]，這些比色方法大多數(shù)依賴(lài)于納米粒子，而粒子合成、修飾過(guò)程復(fù)雜，不易操控。本研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)于ABTS-H2O2反應(yīng)體系具有明顯的催化作用，其催化H2O2氧化ABTS產(chǎn)生有顏色的ABTS·+，而且Cu2+溶液十分容易獲取，性質(zhì)也非常的穩(wěn)定，另外PPi易與Cu2+發(fā)生螯合作用，從而抑制了Cu2+對(duì)于ABTS-H2O2反應(yīng)體系的催化作用，因此，可以建立一種新的分光光度法用于PPi的檢測(cè)。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽、雙氧水(H2O2)、焦磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉、氯化銅、三羥甲基氨基甲烷。

1.2 儀器

UV-1750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、UV-752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人血清樣品的預(yù)處理

取自章丘市中醫(yī)院的人血清樣品：移取8 mL人血清樣品于10 mL離心管中，在轉(zhuǎn)速為3000 r/min的離心機(jī)下離心15 min，用移液槍移出上清液，保存在4℃冰箱內(nèi)待用。

2.2 焦磷酸根的檢測(cè)

用移液槍分別移取150 μL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH值=7.5)緩沖溶液，50 μL不同濃度的PPi溶液，50 μL 3.0×10-3mol/L CuCl2溶液，1170 μL娃哈哈水于1.5 mL離心管中，待反應(yīng)1 min后，加入50 μL 6.0×10-2mol/L ABTS和30 μL 0.1 mol/L H2O2溶液，搖勻混合5 min后測(cè)溶液的吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理以及設(shè)計(jì)方法

圖1 基于Cu2+催化H2O2與ABTS反應(yīng)檢測(cè)PPi的原理圖

圖1為實(shí)驗(yàn)原理的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中Cu+催化H2O2生成羥基自由基(·OH)，ABTS與·OH發(fā)生反應(yīng)生成ABTS·+，使溶液變成綠色，因此在 Cu2+的催化下ABTS與H2O2可以很快的發(fā)生顯色反應(yīng)。當(dāng)加入PPi后，PPi會(huì)與Cu2+發(fā)生螯合作用，從而使Cu2+起不到催化的作用，溶液的顏色也隨之變淺，吸光值也因PPi濃度的不同而發(fā)生變化，該實(shí)驗(yàn)方法就是利用這一反應(yīng)原理對(duì)PPi進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 可行性驗(yàn)證

為了考察該方法的可行性，首先對(duì)Cu2+對(duì)ABTS-H2O2反應(yīng)體系的催化作用進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A所示，將不同濃度的Cu2+加入到H2O2-ABTS體系中，隨著Cu2+濃度不斷增大，在415 nm波長(zhǎng)處，體系的吸光度值也明顯的增加。以上可充分說(shuō)明Cu2+對(duì)ABTS-H2O2反應(yīng)體系具有催化作用的真實(shí)性與可行性。

根據(jù)上述討論結(jié)果可知，Cu+對(duì)Cu2+-ABTS-H2O2反應(yīng)起著關(guān)鍵性的作用。因此，推測(cè)一些配體與Cu2+的螯合作用可能會(huì)改變Cu+與H2O2的氧化還原電位，阻礙了Cu+的生成，進(jìn)而影響了·OH的生成，導(dǎo)致生成的ABTS·+減少，基于這個(gè)假設(shè)，我們研究了PPi是否會(huì)抑制Cu2+催化ABTS-H2O2顯色反應(yīng)，因?yàn)镻Pi可與Cu2+形成穩(wěn)定的螯合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，通過(guò)H2O2-ABTS體系與PPi-H2O2-ABTS體系比較，兩者所測(cè)吸光度值幾乎沒(méi)有差別，可知PPi對(duì)ABTS-H2O2反應(yīng)無(wú)影響。通過(guò)PPi-Cu2+-H2O2-ABTS體系與Cu2+-H2O2-ABTS體系比較，對(duì)于PPi-Cu2+-H2O2-ABTS體系，隨著PPi濃度的減大，所測(cè)的體系吸光度值也逐漸的減小。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的原理是可行的，能用于PPi的檢測(cè)。

圖2 不同條件下樣品的吸收光譜圖

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了讓實(shí)驗(yàn)的效果達(dá)到最佳，分別對(duì)緩沖溶液pH值，Cu2+濃度，H2O2濃度以及Cu2+-PPi反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

體系吸光度的大小與緩沖溶液的pH值有關(guān)。在控制其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液(終濃度0.01 mol/L)對(duì)信噪比A0/Ap的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在pH值為5.5～7.5的范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，A0/Ap的值逐漸的增大，在pH值為7.5～8.5的范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，A0/Ap的值逐漸減小，當(dāng)pH值為7.5時(shí)，體系能達(dá)到最好的信噪比，因此，設(shè)計(jì)選用pH值=7.5的Tris-HCl緩沖溶液。

Cu2+的濃度對(duì)體系的吸收強(qiáng)度也有著很大的影響，因此，進(jìn)行了以下的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在有無(wú)PPi的情況下，通過(guò)加入一系列不同的Cu2+濃度，從而測(cè)得Cu2+-ABTS-H2O2體系的吸光度值(A0)以及PPi+Cu2+-ABTS-H2O2體系的吸光度值(Ap)，結(jié)果當(dāng)Cu2+濃度為1.0×10-4mol/L時(shí)可以獲得最佳的信噪比，所以，Cu2+的最優(yōu)濃度為1.0×10-4mol/L。

H2O2作為反應(yīng)體系的底物，對(duì)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定有重要的影響。因此進(jìn)行了以下優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在PPi+Cu2+-ABTS-H2O2體系中，加入不同濃度的H2O2，其結(jié)果表明，當(dāng) H2O2的濃度在2.0×10-3mol/L之后，其吸光度值趨于平穩(wěn)。因此，H2O2的最適濃度為2.0×10-3mol/L。

由于PPi與Cu2+反應(yīng)的時(shí)間的不同，會(huì)影響到吸光度值的變化，因此，有必要對(duì)PPi-Cu2+反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。在0～60 s范圍內(nèi)，隨著PPi-Cu2+反應(yīng)時(shí)間的增大，體系的吸光度值逐漸減小，之后，體系的吸光度值趨于穩(wěn)定，可見(jiàn)PPi-Cu2+反應(yīng)十分迅速，1 min反應(yīng)即可反應(yīng)完全，該方法的最佳反應(yīng)時(shí)間為1 min。

3.4 PPi標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在實(shí)驗(yàn)條件最優(yōu)的情況下，對(duì)于不同濃度的PPi，在波長(zhǎng)為405～480 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得到了圖3A所示的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖，圖中可以看出，在波長(zhǎng)為415 nm處，溶液的吸光度值隨著PPi濃度的增大而減小，圖3B中，目視法也可以觀察到隨著PPi濃度的增大溶液的顏色逐漸變淺，由圖3C可知，PPi的濃度在1×10-5～1×10-4mol/L范圍內(nèi)與體系吸光度有較好的線性關(guān)系，體系吸光度隨著PPi的濃度增加而逐漸的減小，線性方程為A= -7899.6668C+0.84434(其中，A吸光值，C為PPi的濃度，R2為0.9912)。此外，1.0×10-5mol/L PPi平行測(cè)定3次后計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%，6.0×10-5mol/L PPi平行測(cè)定3次后計(jì)算得到的RSD為2.6%，1.0×10-4mol/L PPi平行測(cè)定3次后計(jì)算得到的RSD為2.2%。

圖3 A不同PPi濃度的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；B不同PPi濃度存在時(shí)的顏色變化；C波長(zhǎng)為418 nm時(shí)不同PPi濃度與吸光度的線性圖

3.5 特異性檢測(cè)

為了驗(yàn)證PPi對(duì)此反應(yīng)的特異性，選擇了PO43-，HPO42-，H2PO4-三種陰離子與PPi進(jìn)行對(duì)照測(cè)定吸光度，為了充分說(shuō)明PPi對(duì)體系有極大的抑制作用，因此選用的其他三種陰離子的濃度比PPi的濃度要大，都為1.0×10-4mol/L，而PPi的濃度選為5.0×10-5mol/L。其測(cè)定的結(jié)果如圖4所示，圖上可以明顯的看出，僅有PPi具有特異性，對(duì)Cu2+-H2O2-ABTS體系有明顯的抑制作用，而PO43-，HPO42-，H2PO4-三種離子對(duì)該體系的吸光度值沒(méi)有明顯的抑制作用并且三者吸光度值相差不大。因此，本研究所構(gòu)建的比色傳感器對(duì)PPi的檢測(cè)具有較高的選擇性和特異性。

圖4 特異性檢測(cè)圖

3.6 人血清樣品分析

為了證明本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)于復(fù)雜的生命體系也可以應(yīng)用，因此對(duì)醫(yī)院取出的人的血清樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如下表，在經(jīng)過(guò)處理的人血清樣品中，加入不同濃度的PPi并測(cè)定其吸光度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著加入的PPi濃度的增加，體系的吸光度值逐漸的減小，并且由下表測(cè)得的數(shù)據(jù)可以知道，PPi在人血清中的加標(biāo)回收率在98.5%～102.4%的范圍內(nèi)，而且RSD的數(shù)值都小于5.0%。因此，本研究實(shí)驗(yàn)在復(fù)雜的生命樣品中也同樣的適用。

表1 血清樣品中PPi的加標(biāo)回收率

4 結(jié)論

本研究利用Cu2+催化ABTS-H2O2反應(yīng)建立了一種簡(jiǎn)便，快速的分光光度法檢測(cè)PPi，基于PPi與Cu2+的螯合作用可以有效的抑制Cu2+的催化能力。與傳統(tǒng)的方法相比較，PPi-Cu2+-H2O2-ABTS體系無(wú)需昂貴的儀器，酶以及納米級(jí)的催化劑參與，并且催化劑性質(zhì)穩(wěn)定。另外，該體系的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程均在液相溶液中進(jìn)行，無(wú)需經(jīng)過(guò)分離，沖洗等復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作，非常的方便。此外，該方法具有很高的選擇性。將本文所建立的體系應(yīng)用于實(shí)際人體血清的檢測(cè)，由加標(biāo)回收率可知，該方法具有很高的可行性。因此本文所建立的分光光度法為PPi的檢測(cè)提供了一種新的途徑。