余柯達(dá) 陳 曉 楊麗華 毛佳婷 鄒立波 師 帥 劉 鴻

金華市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（浙江金華 321000）

自從Palermo等[1]首次通過(guò)卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）獲得妊娠后，男性不育癥患者可通過(guò)ICSI得到有效的治療。對(duì)于男性不育癥中的無(wú)精子癥，在確診梗阻性無(wú)精子癥還是非梗阻性無(wú)精子癥時(shí)需要通過(guò)經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（PESA）和睪丸精子抽吸術(shù)（TESA）進(jìn)行檢查，為避免反復(fù)穿刺給患者帶來(lái)?yè)p傷，很多生殖醫(yī)學(xué)中心會(huì)將檢查后確認(rèn)有精子的PESA和TESA標(biāo)本進(jìn)行冷凍保存，用于后續(xù)的ICSI周期。

不同來(lái)源 （PESA/TESA）的精子是否會(huì)影響ICSI助孕的結(jié)局，目前國(guó)內(nèi)外研究無(wú)統(tǒng)一結(jié)論[2-6]。PESA和TESA精子經(jīng)過(guò)凍融后會(huì)受到一定的損傷，其是否會(huì)影響ICSI助孕的結(jié)局目前還存在爭(zhēng)議。有研究結(jié)果表明凍融的PESA和TESA精子對(duì)ICSI的受精率、早期胚胎質(zhì)量和臨床妊娠率等無(wú)影響[2,7-10]，但也有些學(xué)者認(rèn)為凍融的精子會(huì)對(duì)ICSI助孕結(jié)局造成影響[11,12]。本研究對(duì)在本院生殖中心接受ICSI治療的312個(gè)周期進(jìn)行回顧性分析，旨在探討不同來(lái)源精子（PESA/TESA）和凍融TESA/PESA精子對(duì)ICSI助孕結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2014年1月至2017年2月在金華市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因男方無(wú)精子癥接受采用PESA或TESA精子行ICSI治療的312個(gè)周期。根據(jù)ICSI的精子來(lái)源不同，分為新鮮PESA精子組（P組）117周期，新鮮TESA精子組（T組）66周期，凍融PESA精子組（FP組）85周期，凍融TESA精子組（FT組）44周期。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方至少3次精液分析，經(jīng)離心沉淀后鏡檢未見(jiàn)精子，PESA或TESA可見(jiàn)成熟精子；（2）第1 周期行 ICSI助孕治療；（3）女方年齡＜35 歲；（4）夫婦雙方染色體均正常；（4）女方無(wú)子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢功能衰竭等。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

（一）超排方案

女方超排卵均采用GnRH-a長(zhǎng)方案，注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-a，達(dá)菲林，法國(guó)益普生生物制藥公司）進(jìn)行降調(diào)，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，開(kāi)始注射重組人促卵泡激素（rFSH，果納芬，瑞士雪蘭諾公司）或人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG，珠海麗珠公司）促排卵，并根據(jù)卵泡發(fā)育、子宮內(nèi)膜及血清雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）的值調(diào)整劑量，當(dāng)至少3個(gè)卵泡≥18 mm時(shí)停用促排藥，注射人絨毛膜促性腺激素（hCG，艾澤，瑞士雪蘭諾公司）6000 U，36 h后取卵。

（二）PESA和TESA精子獲取、冷凍和復(fù)蘇

1.PESA：患者取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾，進(jìn)行局部麻醉。經(jīng)皮穿刺附睪頭部，抽取附睪液，并在倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)精子。若附睪液中無(wú)活動(dòng)精子，甚至無(wú)精子，則行對(duì)側(cè)附睪穿刺。若兩側(cè)附睪均無(wú)精子，則行TESA。

2.TESA：消毒麻醉同PESA，經(jīng)皮穿刺睪丸，抽吸出睪丸組織液和少量生精小管，將生精小管撕碎后，在倒置顯微鏡下檢查有無(wú)精子。若無(wú)精子，則穿刺對(duì)側(cè)睪丸。

精子冷凍和復(fù)蘇參照精子冷凍液（vitrolife）的使用說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。

（三）受精、卵裂、胚胎質(zhì)量觀察及妊娠結(jié)局隨訪

取卵當(dāng)天行常規(guī)ICSI，受精16～18 h后觀察受精情況，其中2 PN為正常受精，再觀察第2天和第3天胚胎卵裂情況，第3天早期胚胎的卵裂球≥6，細(xì)胞大小均勻或基本均勻，碎片≤20%為優(yōu)質(zhì)胚胎，選擇正常受精卵卵裂而來(lái)的優(yōu)質(zhì)胚胎或有效胚胎進(jìn)行移植。胚胎移植30 d后B超檢查宮腔，內(nèi)見(jiàn)孕囊確診為臨床妊娠。對(duì)妊娠夫婦每3個(gè)月進(jìn)行一次隨訪并作記錄。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)病例數(shù)≥40且理論頻數(shù)≥5時(shí)，采用普通卡方檢驗(yàn)；當(dāng)病例數(shù)≥40，但1≤理論頻數(shù)＜5時(shí)，采用校正的卡方檢驗(yàn)；當(dāng)病例數(shù)＜40或理論頻數(shù)＜1時(shí)，采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、凍存附睪、睪丸精子的復(fù)蘇情況和患者基礎(chǔ)臨床資料比較

85個(gè)周期凍存附睪精子和44個(gè)周期凍存睪丸精子進(jìn)行復(fù)蘇后，每個(gè)周期均能找到足夠數(shù)量的活動(dòng)精子進(jìn)行ICSI，附睪、睪丸精子的凍融復(fù)蘇成功率均為100%?；颊呋A(chǔ)臨床資料方面，4組之間的女方年齡、男方年齡和不孕年限均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表 1）。

二、受精情況與胚胎質(zhì)量

由表1可知，P組的受精率為78.12%，而T組僅為71.04%，具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。精子經(jīng)過(guò)冷凍復(fù)蘇后，F(xiàn)P組的受精率仍高達(dá) 77.65%，F(xiàn)T組為69.57%，F(xiàn)P組與P組、FT組與T組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且FP組的受精率顯著高于FT組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。P組、T組、FP組和FT組的卵裂率分別為97.45%、97.93%、96.86%和98.18%，精子不同來(lái)源的P組與T組、FP組與FT組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且經(jīng)過(guò)冷凍復(fù)蘇后的FP組、FT組的卵裂率也與采用新鮮精子的P組、T組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。有效胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率也與卵裂率情況一致。總之，除不同來(lái)源的精子之間受精率有顯著差異性（P＜0.01）之外，不同來(lái)源的精子，無(wú)論是新鮮的還是凍融的精子，其卵裂率、有效胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

三、臨床妊娠情況比較

胚胎移植后，P組、T組、FP組和FT組的胚胎種植率分別為31.19%、30.36%、31.25%和33.33%，精子不同來(lái)源的P組與T組、FP組與FT組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且經(jīng)過(guò)冷凍復(fù)蘇后的FP組、FT組的胚胎種植率也與采用新鮮精子的P組、T組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠率也與胚胎種植率一致。不同來(lái)源的精子，無(wú)論是新鮮還是凍融的精子其胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表 2）。

表1 4組基本情況和胚胎發(fā)育情況比較

表2 4組臨床妊娠情況比較

討 論

一個(gè)成熟的精子必須具備一些生理生化指標(biāo)才能使它獲得受精能力，然而顯微操作輔助的受精實(shí)驗(yàn)表明大多數(shù)的高度特化精子在成熟過(guò)程中逐漸獲得的功能只需要將精子的細(xì)胞核注射到卵子就能代替那些功能，從而激活卵子[1]。因此ICSI技術(shù)成為了男性不育癥患者，特別是無(wú)精子癥患者的有效治療方式，梗阻性無(wú)精子癥和非梗阻性無(wú)精子癥患者通過(guò)PESA或TESA獲得附睪或睪丸精子行ICSI治療。不同來(lái)源的精子對(duì)ICSI治療中的胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局的影響，目前國(guó)內(nèi)外的研究均無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。

王俊霞等[3]報(bào)道PESA/TESA不同來(lái)源的精子對(duì)受精率、卵裂率、臨床妊娠率等均無(wú)顯著差異，但PESA的流產(chǎn)率顯著低于TESA。冼志勇等[13]也認(rèn)為PESA和TESA之間的臨床妊娠率無(wú)顯著性差異。而有些研究結(jié)果表明附睪來(lái)源的精子受精率顯著高于TESA，且流產(chǎn)率差異無(wú)顯著性[4,5]。Dozortsev等[6]的研究結(jié)果則認(rèn)為不同精子來(lái)源中的PESA的受精率雖然顯著高于TESA，但臨床妊娠率顯著低于TESA，流產(chǎn)率則高于TESA。而董瑞娜等[2]認(rèn)為不僅PESA的受精率、卵裂率顯著高于TESA，而且胚胎種植率、臨床妊娠率也顯著高于TESA。本研究結(jié)果表明，新鮮PESA精子組（P組）的受精率為78.12%，而新鮮TESA精子組（T組）僅為71.04%，具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），而卵裂率、有效胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠率兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），凍融后的FP組和FT組之間也具有上述同樣的結(jié)果，這與林小民[4]和謝多等[5]的研究結(jié)果一致。在睪丸中精子具備完整的父源遺傳物質(zhì)，已完成減數(shù)分裂，在循附睪頭體尾運(yùn)動(dòng)和在附睪儲(chǔ)存的過(guò)程中，精子的形態(tài)和生理生化功能進(jìn)一步發(fā)生改變，最終獲得運(yùn)動(dòng)能力、精卵識(shí)別能力和受精能力，因此睪丸中的精子對(duì)卵子的激活能力比附睪中的低，所以導(dǎo)致TESA精子的受精率顯著低于PESA精子。

凍融TESA和PESA精子對(duì)ICSI助孕結(jié)局的影響目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的結(jié)論。Romero等[11]認(rèn)為凍融睪丸精子的受精率高于新鮮睪丸精子，對(duì)卵裂率和胚胎質(zhì)量無(wú)影響。而Verheyen等[12]則認(rèn)為凍融睪丸精子對(duì)受精率無(wú)影響，但嚴(yán)重降低了卵裂率。然而國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究結(jié)果表明[2,7-10]，凍融TESA和PESA與新鮮TESA和PESA之間的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、多胎率、流產(chǎn)率和異位妊娠率等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果也表明凍融TESA和PESA精子對(duì)ICSI結(jié)局中的受精率、卵裂率、有效胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠率無(wú)影響。究其原因可能是在精子冷凍和復(fù)蘇的過(guò)程中雖然會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生損傷，但也起到了篩選的作用，只有代謝旺盛、活力好的精子才能存活下來(lái)。

受目前試管嬰兒成功率的限制，無(wú)精子癥患者可能會(huì)進(jìn)行多次附睪或睪丸穿刺，還要面臨取不到精子的可能，重復(fù)的睪丸手術(shù)取精會(huì)導(dǎo)致患者睪丸的損傷和大量的睪丸組織丟失，并引起睪丸組織纖維化、睪丸萎縮等并發(fā)癥[10]。因此本文建議將檢查到具有精子的附睪和睪丸活檢的樣品或ICSI治療周期剩余的PESA和TESA精子進(jìn)行冷凍保存，可用于接下來(lái)的ICSI周期，避免患者多次附睪或睪丸穿刺取精帶來(lái)的損傷。