韓 錦 姚智會(huì) 馬曉桃 桂保松

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，陜西西安 710004；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710004

心血管疾病是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者首要死亡原因，其中血管鈣化（vascular calcification，VC）是心血管疾病的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-5］。CKD 患者鈣磷代謝紊亂導(dǎo)致血管平滑肌中羥基磷灰石（HAP）的形成，是VC 的關(guān)鍵啟動(dòng)和進(jìn)展因素［6-7］。本課題組以往研究［8］納米羥基磷灰石（nano-HAP）晶體可誘導(dǎo)小鼠血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS）的細(xì)胞凋亡和壞死，加速VC 的發(fā)生。海藻異枝麒麟菜多糖（ESP）是一種以1,3-β-D-半乳吡喃糖和1,4-α-D-半乳吡喃糖作為基本骨架的直鏈硫酸酯多糖［9］，在醫(yī)療領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。已有研究報(bào)道了海藻多糖在抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抑制平滑肌細(xì)胞增生等方面的應(yīng)用［10-13］。然而，目前尚沒有將ESP 用于預(yù)防和治療VC 方面的報(bào)道。本研究擬探討ESP 對(duì)nano-HAP 損傷的血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用，為研究ESP 防治CKD 的VC 治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

試劑：nano-HAP（純度≥97%，粒徑＜100 nm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CCK-8 試劑（日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)：20180730-1）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190831）；蘇木精（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20150623）；ESP 由暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所歐陽建明教授贈(zèng)予；MOVAS（廣州吉妮歐生物科技有限公司）。

儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，311，美國）；超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝，JY92-IIN）；酶標(biāo)儀（Thermo MultiskanMK3，美國）；顯微鏡下觀察（OLYMPUS，CKX41，日本）；多功能酶標(biāo)儀（molecular devices，spectra-MaxM5，美國）；離心機(jī)（Thermo，Labofuge300，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4 代MOVAS 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)分為3 組：空白對(duì)照組：加入無血清培養(yǎng)液；模型組（nano-HAP 晶體處理組）：加入含有200 μg/mL nano-HAP 晶體的無血清培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組（多糖處理組）：在含有200 μg/mL nano-HAP 晶體的無血清培養(yǎng)基中分別加入濃度為50、150、450 μg/mL 的ESP。分為低濃度（50 μg/mL）、中濃度（150 μg/mL）、高濃度（450 μg/mL）3 組。每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。5.0×104個(gè)/mL MOVAS 細(xì)胞懸液每孔100 μL/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后，棄掉培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1 次?？瞻讓?duì)照組換為無血清培養(yǎng)液，模型組和實(shí)驗(yàn)組換為含nano-HAP 的無血清培養(yǎng)液。在培養(yǎng)2 h 后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的ESP。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用MTT 法測量各組細(xì)胞的活力，每孔加10 μL 的CCK-8 試劑，避光孵育1.5 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量吸光度（A），求得3 個(gè)復(fù)孔A 值的平均值。

1.2.3 細(xì)胞LDH 釋放量檢測 實(shí)驗(yàn)分組參照“1.2.2”進(jìn)行。增設(shè)最大酶活性組，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。5.0×104個(gè)/mL MOVAS 細(xì)胞懸液每孔200 μL/孔接種于48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后，棄掉培養(yǎng)液，PBS 清洗1 次?？瞻讓?duì)照組和最大酶活性組換為無血清培養(yǎng)液，模型組和實(shí)驗(yàn)組換為含nano-HAP 的無血清培養(yǎng)液。在培養(yǎng)2 h 后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的ESP。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，各組均按LDH 試劑盒測試方法用酶標(biāo)儀測定OD 值，求得3 個(gè)復(fù)孔A 值的平均值。LDH 釋放率（%）=（處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）/（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）×100%。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察細(xì)胞形貌 實(shí)驗(yàn)分組參照1.2.2 進(jìn)行，MOVAS 細(xì)胞按濃度為1.5×105個(gè)/mL接種于12 孔培養(yǎng)板。把種好細(xì)胞的爬片用PBS 清洗2 次，用4%的多聚甲醛于室溫固定15 min，再用PBS清洗3 次，用蘇木精染色15 min，用水沖洗3 次，換用新鮮的蒸餾水再洗滌2 min，用伊紅染色液染色5 min，用水沖洗3 次，換用新鮮的蒸餾水再洗滌2 min，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。比較采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESP 對(duì)nano-HAP 誘導(dǎo)的MOVAS 活力的影響

Nano-HAP 處理MOVAS 以及不同濃度多糖干預(yù)之后，各組細(xì)胞活力如圖1A 所示，空白對(duì)照組細(xì)胞活力設(shè)為100%。與空白對(duì)照組比較，模型組的細(xì)胞活力減少至（42.5±8.9）%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。

加入不同濃度（50、150、450 μg/mL）的ESP 進(jìn)行保護(hù)后，細(xì)胞活力升高到（51.3±5.8）%、（59.2±7.6）%、（72.1±9.8）%，與模型組比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01），低濃度組與中、高濃度組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），中濃度組與高濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 ESP 降低nano-HAP 誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的LDH 釋放率

將最大酶活性組LDH 釋放率設(shè)為100%，各組細(xì)胞的LDH 釋放率如圖1B 所示，空白對(duì)照組釋放率為（18.1±4.8）%，而模型組為（52.2±5.1）%，比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。隨著ESP 濃度從50 μg/mL升高到450 μg/mL，LDH 釋放量依次降低至（41.2±4.9）%、（35.8±5.8）%和（31.8±5.0）%，低濃度組與中、高濃度組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），中濃度組與高濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 HE 染色觀察細(xì)胞形貌

采用HE 染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色可以觀察細(xì)胞的形態(tài)變化?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞形態(tài)光滑飽滿，呈長梭形，見圖2a（封四）。而模型組細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密，見圖2b（封四），并且細(xì)胞數(shù)量減少。實(shí)驗(yàn)組在加入不同濃度的多糖進(jìn)行保護(hù)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形貌處在對(duì)照組與模型組之間，見圖2c～e（封四）。

圖1 ESP 對(duì)nano-HAP 誘導(dǎo)損傷MOVAS 細(xì)胞活力和LDH 釋放量的影響

3 討論

VC 是慢性腎臟病患者的常見并發(fā)癥。VC 是一個(gè)包含平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的類似骨形成的生理過程［14-15］。納米級(jí)磷酸鈣晶體能夠通過誘導(dǎo)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換來誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化，并且細(xì)胞鈣化程度與磷酸鈣晶體作用時(shí)間呈正相關(guān)［16-17］。在培養(yǎng)基中添加HAP 引起血管平滑肌損傷過程與體內(nèi)HAP 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的過程類似。因此，本研究采用nano-HAP 晶體誘導(dǎo)MOVAS 損傷的模型，觀察了ESP 對(duì)血管平滑肌的保護(hù)作用。

本研究首先通過MTT 法檢測不同濃度ESP 對(duì)nano-HAP 晶體損傷的MOVAS 活力的影響，結(jié)果表明ESP 能夠抑制nano-HAP 晶體導(dǎo)致的MOVAS 損傷，且在50～450 μmol/L 呈明顯的濃度依賴性。多糖對(duì)細(xì)胞的修復(fù)或者保護(hù)所用的濃度范圍很廣。Li 等［18］研究顯示濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL 的Morchella esculenta 多糖抑制了H2O2引起的A549 細(xì)胞的凋亡與氧化應(yīng)激；Liang 等［19］也發(fā)現(xiàn)在濃度范圍為5～1000 μg/mL 的紅藻多糖對(duì)HUVEC 無毒性并且刺激細(xì)胞的增殖，當(dāng)濃度為800 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞的活力達(dá)到了140%。因此本研究選擇了50、150、450 μg/mL。

LDH 是細(xì)胞漿內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞損傷調(diào)亡而造成的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變時(shí)，胞內(nèi)的LDH 會(huì)透過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，因此LDH 的檢測可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞膜破壞程度的重要指標(biāo)［20］。本研究通過檢測從細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH 的含量，定量分析了加入nano-HAP 對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度，發(fā)現(xiàn)nano-HAP 晶體可破壞MOVAS 細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致LDH 釋放增加。而加入不同濃度的ESP 多糖后能明顯減少LDH 的釋放量。提示ESP 對(duì)MOVAS 細(xì)胞有保護(hù)作用，且在450 μg/mL 濃度內(nèi)，隨著ESP 濃度增加，保護(hù)效果增強(qiáng)。

本研究采用HE 染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過nano-HAP 損傷后的細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，而加入不同濃度的多糖進(jìn)行保護(hù)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形貌處在空白對(duì)照組與模型組之間，且ESP 濃度越高，保護(hù)作用越強(qiáng)。

綜上所述，本研究采用nano-HAP 晶體誘導(dǎo)MOVAS損傷的模型，觀察了ESP 對(duì)血管平滑肌的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，ESP 通過抑制HAP 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞活力下降、LDH 釋放率增高，從而發(fā)揮其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用。因缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，本研究的結(jié)果具有一定的局限性，但是為研究ESP 抗血管鈣化的機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。