苗明三 彭孟凡 方曉艷 賈佼佼 白 明

河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，鄭州，450046，中國(guó)

腦血管疾病是危害中老年人健康的常見(jiàn)疾病之一，缺血區(qū)血流的再灌注可引起腦組織損傷及相關(guān)功能障礙更加嚴(yán)重，即腦缺血再灌注損傷［1］。腦缺血再灌注損傷過(guò)程中可引起一系列細(xì)胞、分子及其調(diào)節(jié)過(guò)程的變化，是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺損的重要原因和全球死亡的第2 大常見(jiàn)原因。中醫(yī)學(xué)具有整體觀念的特點(diǎn)，中藥具有作用于多靶點(diǎn)的特征，從而干預(yù)腦缺血損傷病理過(guò)程多條路徑，防治腦缺血損傷，且毒副作用低，日益受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。隨著年齡的增大，老年患者身體機(jī)能逐漸衰退，五臟皆氣虛，導(dǎo)致血液運(yùn)行不暢甚至瘀阻。故中醫(yī)認(rèn)為，氣虛、血瘀、熱毒在腦缺血疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占據(jù)主要因素。基于此，腦缺血適合采用活血化瘀藥和清熱解毒藥治療。

大血藤始載于《本草圖經(jīng)》，具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)止痛之功效［2］。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，大血藤水煎液具有較好的抗腦缺血作用，大血藤的化學(xué)成分以酚酸類(lèi)為主，酚酸類(lèi)物質(zhì)作為一類(lèi)具有獨(dú)特生理和藥理活性的天然產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，在抗腫瘤、防衰老和抗炎免疫等方面都具有良好的功效。但目前大血藤總酚酸對(duì)腦缺血再灌注的相關(guān)報(bào)道較少，近年研究表明，氧化應(yīng)激與能量代謝障礙在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［3-4］。本實(shí)驗(yàn)主要觀察大血藤總酚酸對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平和能量代謝的影響，為其防治缺血性腦血管疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar 大鼠，SPF 級(jí)，♂，98 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：37005400 000023；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批號(hào)：DWLL 15010017，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.1.2 藥品與試劑

大血藤總酚酸，由河南中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)室提供，福林酚法測(cè)定含量為70.04%；尼莫地平片，批號(hào)140861，購(gòu)自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；腦絡(luò)通膠囊，批號(hào)150401，購(gòu)自吉林金寶藥業(yè)股份有限公司；氯化苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC），批號(hào)04102711，購(gòu)自中國(guó)華東師范大學(xué)化工廠（上海）；ATP 酶試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，批號(hào)分別為20150826、20150821 和20150901，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

線(xiàn)栓，產(chǎn)品號(hào)2838-A4，北京西濃生物技術(shù)有限公司；電子分析天平，型號(hào)FA2204B，上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，型號(hào)TDL-40B，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，型號(hào)：BIORAD-680，美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與給藥

98 只大鼠正常飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（20 mg·kg-1）、腦絡(luò)通組（500 mg·kg-1）以及大、中、小劑量大血藤總酚酸組（300、150、75 mg·kg-1），每組14 只，連續(xù)給予相應(yīng)藥物7 d，1 次·d-1。假手術(shù)組及模型組分別灌胃等體積溶劑。給藥第6 d 晚上禁食，第7 d 早上給藥1 h 后，麻醉，手術(shù)造模。

造模方法與參考文獻(xiàn)［5-6］，基本操作為：用眼科剪于頸正中部開(kāi)口，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈并穿線(xiàn)備用。于頸總動(dòng)脈距分叉5 mm 處剪開(kāi)一小口，將線(xiàn)栓經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉部插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至有阻力，2 h 后輕輕抽出栓線(xiàn)至略有阻力，實(shí)現(xiàn)再灌注，建立腦缺血-再灌注動(dòng)物模型。假手術(shù)組僅暴露左側(cè)血管，不做插線(xiàn)處理。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法

造模及給藥結(jié)束后脫頸處死大鼠，剝?nèi)∧X組織，放入-20℃低溫冰箱中冷卻15 min 后剔除小腦、嗅球和低位腦干后的剩余部分，沿冠狀面切成2 部分。

第一部分為腦前極至視交叉冠狀面前1 mm 處，矢狀切取左側(cè)腦組織（插線(xiàn)栓側(cè)），并用生理鹽水制成10%的腦勻漿，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝，-20℃保存，待測(cè)ATP 酶活力，SOD、MDA 水平。

第二部分為視交叉冠狀面前后1 mm 處，切成約2 mm 的薄片，置pH=7.2 磷酸鹽緩沖液配制的1%TTC染液中，37℃水浴、避光條件下孵育10 min。取出，于10%福爾馬林液中避光保存24 h。染色后未梗死的腦組織為玫瑰紅色，梗死的腦組織為白色。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析并計(jì)算梗死區(qū)面積，求其占總面積的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大血藤總酚酸對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦梗死面積百分比的影響

由Tab.1 和Fig.1 可以看出，與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦梗死面積百分比均顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明造模成功；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大血藤總酚酸大劑量組大鼠腦梗死面積百分比顯著降低（P＜0.01）；中劑量組和小劑量組大鼠腦梗死面積百分比明顯降低（P＜0.05）。大血藤總酚酸對(duì)腦梗死面積的改善作用呈劑量依賴(lài)性，且大劑量組的改善作用接近腦絡(luò)通組，稍弱于尼莫地平組。

2.2 大血藤總酚酸對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿MDA 和SOD 水平的影響

由Tab.2 知：與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠腦勻漿MDA 含量顯著升高、SOD 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組、大血藤總酚酸大劑量組腦勻漿MDA 水平顯著降低（P＜0.01），SOD水平顯著升高（P＜0.01）；中劑量組腦勻漿MDA 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 水平顯著升高（P＜0.01）；小劑量組腦勻漿MDA 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 水平明顯升高（P＜0.05）。大血藤總酚酸對(duì)MDA 和SOD 的改善作用呈劑量依賴(lài)性，且大劑量組的改善作用接近腦絡(luò)通組，稍弱于尼莫地平組。

Tab.1 Effects on cerebral infarction area percentage in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Tab.1 Effects on cerebral infarction area percentage in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Fig.1 TTC staining of focal cerebral ischemia reperfusion model in rats

Tab.2 Effects of MDA and SOD levels in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Tab.2 Effects of MDA and SOD levels in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

2.3 大血藤總酚酸對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿Na+-K+-ATP 酶活力和Mg2+-ATP 酶活力的影響

由Tab.3 知，與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦組織Na+-K+-ATP 酶和Mg2+-ATP 酶活力均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大血藤總酚酸大劑量組大鼠腦勻漿Na+-K+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶活力均顯著升高（P＜0.01），中劑量組大鼠腦勻漿Na+-K+-ATP 酶活力明顯升高（P＜0.05），Mg2+-ATP 酶活力顯著升高（P＜0.01）；小劑量組大鼠腦勻漿Mg2+-ATP 酶活力明顯升高（P＜0.05）。大血藤總酚酸對(duì)Na+-K+-ATP 酶和Mg2+-ATP 酶活力的改善作用呈劑量依賴(lài)性，且大劑量組的改善作用接近尼莫地平組，稍弱于腦絡(luò)通組。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣虛、血瘀、熱毒是影響腦缺血發(fā)病的主要因素，活血化瘀藥與補(bǔ)虛藥在治療腦缺血疾病中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值［7-8］。但是，清熱解毒法的應(yīng)用較少。隨著對(duì)傳統(tǒng)毒邪認(rèn)識(shí)的深化，聯(lián)系“中風(fēng)熱毒論”假說(shuō)與“毒損腦絡(luò)”的病機(jī)學(xué)說(shuō)，從“毒”論治中風(fēng)已成為中風(fēng)疾病臨床及機(jī)制的深入研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)總結(jié)文獻(xiàn)報(bào)道，打破長(zhǎng)期以來(lái)用“活血化瘀”為主的原則治療本病，提出了運(yùn)用“活血化瘀兼清熱解毒”的中藥防治腦缺血的觀點(diǎn)［9］。

大血藤具有活血化瘀、清熱解毒的功效。藥理研究表明，大血藤對(duì)DPPH 具有較高的清除率、對(duì)黃嘌呤氧化酶活性具有抑制作用、對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD 和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）具有增強(qiáng)作用，表現(xiàn)出抗氧化活性［10-11］，且對(duì)心血管系統(tǒng)有較好的保護(hù)作用［12］，而其化學(xué)成分以酚酸類(lèi)為主。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，大血藤總酚酸可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織炎癥反應(yīng)、抑制腦細(xì)胞調(diào)亡，改善海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)的病理性變化；同時(shí)，可降低腦缺血再灌注損傷大鼠的死亡率、降低神經(jīng)功能缺失評(píng)分［13］，但并未進(jìn)行其對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平和能量代謝的影響。腦絡(luò)通膠囊具有補(bǔ)氣活血，通經(jīng)活絡(luò)之功效，可擴(kuò)張血管、增加腦血流量作用［14］；尼莫地平是脂溶性鈣通道阻滯劑，是抗氧化應(yīng)激類(lèi)神經(jīng)保護(hù)藥物，對(duì)既往損傷區(qū)灌注不足部位灌注量的增加通常高于正常區(qū)域，具有保護(hù)神經(jīng)元和抗腦血管收縮的雙重作用［15］。因此，將腦絡(luò)通與尼莫地平作為陽(yáng)性藥，以觀察大血藤總酚酸對(duì)局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平和能量代謝的影響。

Tab.3 Effects of Na+-K+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyme levels in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Tab.3 Effects of Na+-K+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyme levels in rats with focal cerebral ischemia reperfusion ()

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

目前，普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙在腦缺血再灌注后引起的腦組織損傷過(guò)程中扮演重要角色。腦組織耗氧量高，最易受氧自由基的侵襲傷害［16］。SOD 是生物體內(nèi)清除氧自由基最為重要的抗氧化酶，能有效地清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，并有終止自由基連鎖反應(yīng)的作用。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，其積累過(guò)多可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損［17-18］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大血藤總酚酸各劑量組均能不同程度降低MDA 活性、升高SOD活性，表明大血藤總酚酸具有減少模型大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的作用。腦組織對(duì)缺血、缺氧極度敏感，腦缺血早期即可出現(xiàn)腦細(xì)胞氧化磷酶化功能降低，ATP酶活力的高低可以反映細(xì)胞能量代謝水平。腦缺血時(shí)，由于線(xiàn)粒體功能障礙，ATP 生成減少，Na+-K+-ATP酶功能障礙，細(xì)胞內(nèi)Na+增加，激活Na+-Ca2+交換體，Ca2+超載產(chǎn)生能量代謝障礙、加重腦組織損傷如此形成惡性循環(huán)，進(jìn)而線(xiàn)粒體凋亡途徑啟動(dòng)引起神經(jīng)元死亡［19］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大血藤總酚酸各劑量組均能不同程度升高Na+-K+-ATP 和Mg2+-ATP 酶活性，表明其具有改善缺血再灌注模型大鼠腦組織能量代謝障礙的作用。

大血藤總酚酸可降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積、改善腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和能量代謝障礙，效果呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，且具有一定優(yōu)勢(shì)，及其縮小腦梗死及改善腦組織氧化應(yīng)激的能力與腦絡(luò)通接近，改善能量代謝的能力與尼莫地平接近，為大血藤總酚酸防治缺血性腦血管疾病的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。