張程美 王高頻

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，錦州 121000)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)以不平衡的脂質(zhì)代謝激活固有免疫系統(tǒng)，誘發(fā)免疫細(xì)胞積聚于動脈壁為特征，固有免疫細(xì)胞釋放的蛋白水解酶、炎癥細(xì)胞因子及趨化因子之間的相互作用是導(dǎo)致粥樣斑塊形成與發(fā)展的主要原因，AS屬于慢性炎癥性免疫疾病[1,2]。巨噬細(xì)胞作為AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞，出現(xiàn)于AS各階段[3]，其高表達(dá)的模式識別受體Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4)，通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)在AS過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因缺陷小鼠巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的TNF-α分泌減少，小鼠在主動脈中形成更少的動脈粥樣硬化病變，提示TLR4能促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成[5]。

目前，臨床多采用他汀類西藥治療AS，能有效減少胞內(nèi)膽固醇和脂蛋白的合成和分泌，抑制血管炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮功能，穩(wěn)定粥樣斑塊，延緩AS程度等作用，但會引發(fā)肝功能受損、肌肉疼痛等毒副作用，使其在臨床應(yīng)用中受到限制[6]。我國藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有調(diào)脂降壓、抗炎、抗氧化、抗血栓、改善血管內(nèi)皮功能、擴(kuò)張冠狀動脈等心血管系統(tǒng)保護(hù)功效[7,8]。最近研究表明，葛根素具有抗動脈粥樣硬化功效，但機(jī)制尚不明確[9]。內(nèi)皮下巨噬細(xì)胞通過攝取大量氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)形成泡沫細(xì)胞，并與壞死細(xì)胞碎片共同構(gòu)成AS斑塊的脂質(zhì)核心[10,11]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過葛根素低、高劑量干預(yù)oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞，以TLR4-NF-κB通路為切入點(diǎn)，探討葛根素抗AS的潛在機(jī)制，以期為優(yōu)化臨床AS治療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 THP-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；葛根素(C21H20O9，分子量416.378)購自浙江康恩貝制藥股份有限公司(規(guī)格2 ml：0.1 g，國藥準(zhǔn)字H33020186)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)購自美國Sigma公司；MTS試劑盒購自美國Biolegend公司；Rneasy?Mini Kit購自德國Qiagen公司；One step SYBR?Prime ScriptTMRT-PCR Kit購自日本TaKaRa公司；TLR4、MyD88、NF-κB、β-actin抗體、HRP IgG二抗購自美國Invitrogen公司；含DAPI的抗熒光淬滅封片劑、Triton X-100、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清+100 U/ml 青霉素+ 100 μg/ml鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞呈對數(shù)生長時(shí)用100 nmol/L PMA刺激24 h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：對照組、oxLDL組、葛根素低劑量組和葛根素高劑量組。對照組：僅加入RPMI1640培養(yǎng)液，oxLDL組：RPMI1640培養(yǎng)液+oxLDL(50 μg/ml)，葛根素低/高劑量組：RPMI1640培養(yǎng)液+oxLDL(50 μg/ml)+葛根素(低/高劑量的確定依據(jù)MTS結(jié)果)。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(qPCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光)。

1.2.2MTS法檢測細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h。加入oxLDL(50 μg/ml)及不同濃度(10、50、100、500、1 000、2 000 μg/ml)的葛根素處理細(xì)胞，每個(gè)濃度做4個(gè)復(fù)孔。設(shè)置對照孔(僅加oxLDL)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加MTS 20 μl/孔，輕振均勻，用錫紙避光，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀上輕振混勻(10 s/次×3次)，波長490 nm測OD值。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 單細(xì)胞懸液制備：用無菌吸管將孔內(nèi)的液體吸至15 ml離心管中，取2 ml預(yù)冷的PBS反復(fù)輕吹孔內(nèi)細(xì)胞，將孔內(nèi)細(xì)胞全部轉(zhuǎn)至15 ml離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞。細(xì)胞染色：加入Annexin V-FITC 5 μl和7-AAD 3 μl，Votex。室溫避光孵育5～15 min。流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4qPCR檢測IL-6、TNF-α、IL-1β及TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 取200 μl細(xì)胞沉淀用Rneasy?Mini Kit提取細(xì)胞總RNA，步驟按Qiagen說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：42℃ 5 min，94℃ 10 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40 cycles；繪制溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用公式2-ΔΔCT計(jì)算待檢指標(biāo)mRNA的相對表達(dá)。引物見表1。

1.2.5Western blot檢測TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá) 在各組細(xì)胞中加入適量的Lysis buffer與PMSF混合液，裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，取少量上清進(jìn)行BCA定量。用Protein loading buffer將各組細(xì)胞定等濃度后，100℃變性10 min，分裝，-80℃保存。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白。120 mA 100 min轉(zhuǎn)PVDF膜，BSA室溫封閉1 h。加1∶500 TLR4/1∶1 000 MyD88/1∶1 000 NF-κB/1∶5 000 β-actin一抗稀釋液，4℃搖床過夜。TBST洗滌3遍，1∶5 000 HRP IgG二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3遍，加入ECL顯色劑A，B。ECL化學(xué)發(fā)光成像，用Image J軟件分析條帶灰度值。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

PrimerDirectionSequenceProduct(bp)IL-6F5′-TGGTCTTTTGGAGTTTGAGG-3′172R5′-GCTGGCATTTGTGGTTGG-3′TNF-αF5′-TGCTCCTCACCCACACCAT-3′225R5′-GCCCAGACTCGGCAAAGTC-3′IL-1βF5′-GGCTTATTACAGTGGCAATG-3′136R5′-GTAGTGGTGGTCGGAGAT-3′TLR4F5′-TGAGCAGTCGTGCTGGTATC-3′167R5′-CAGGGCTTTTCTGAGTCGTC-3′MyD88F5′-GCACATGGGCACATACAGAC-3′120R5′-TAGCTGTTCCTGGGAGCTGT-3′NF-κB F5′-CAATGCCCTTTTCGACTACGC-3′274R5′-AGCCCTCAGCAAATCCTCCA-3′GAPDHF5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′214R5′-GCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′

1.2.6細(xì)胞免疫熒光對TLR4定位 步驟：①各組細(xì)胞爬片。②4%多聚甲醛1 ml/孔，固定15 min，預(yù)冷PBS清洗，5 min/次×3次。③透膜：0.5% Triton X-100 1 ml/孔，20 min，預(yù)冷PBS清洗，5 min/次×3次。④2%BSA封閉30 min，加入TLR4稀釋液(1∶200)200 μl/孔，4℃過夜。⑤預(yù)冷PBS清洗，5 min/次×3次，加入1∶1 000稀釋的DyLight488標(biāo)記的二抗，200 μl/孔，室溫避光1 h。⑥預(yù)冷PBS清洗，5 min/次×3次，用鑷子將爬片從培養(yǎng)板孔中取出，在爬片細(xì)胞面滴加25 μl含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，蓋在潔凈的封片上，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞 倒置顯微鏡下觀察未分化THP-1單核細(xì)胞多呈圓形、類圓形，透亮狀。經(jīng)PMA誘導(dǎo)24 h后向THP-1巨噬細(xì)胞分化，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈梭形，偽足狀。見圖1。

圖1 THP-1單核/巨噬細(xì)胞光鏡形態(tài)(×100)Fig.1 Light microscopic morphology of THP-1 monocyte macrophages (×100)

2.2不同濃度葛根素對oxLDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞增殖的影響 與對照組(oxLDL)比較，葛根素濃度為10、50、100 μg/ml時(shí)對THP-1細(xì)胞增殖水平無明顯作用(P>0.05)。當(dāng)葛根素濃度增至500、1 000、2 000 μg/ml時(shí)，明顯抑制THP-1細(xì)胞增殖能力(P<0.01)， 且呈劑量依賴性，即藥物濃度越高對細(xì)胞增殖的抑制性就越強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取的葛根素低、高劑量分別為10 μg/ml和100 μg/ml。見圖2。

圖2 葛根素對oxLDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞增殖作用Fig.2 Puerarin on oxLDL-induced proliferation of THP-1 macrophagesNote:Compared to LDL group,**.P<0.01.

2.3葛根素對oxLDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡的影響 oxLDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞主要發(fā)生細(xì)胞的早期凋亡，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低、高劑量葛根素組在葛根素干預(yù)24 h時(shí)能明顯降低細(xì)胞凋亡比例，與oxLDL組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而高劑量組凋亡比例低于低劑量組(P<0.05)。見圖3、4。

圖3 葛根素降低oxLDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡比例Fig.3 Puerarin reduced proportion of oxLDL-induced apoptosis in THP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerain group;D.High-dose of puerain group.

圖4 葛根素降低oxLDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡比例Fig.4 Puerarin reduced proportion of oxLDL-induced apoptosis in THP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerarin group;D.High-dose of puerarin group;Group A,C,D compared with group B,**.P<0.01.

2.4IL-6、TNF-α、IL-1β及TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá) oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞能顯著提高細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β及TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)量(P<0.01)；與oxLDL組比較，葛根素低、高劑量組IL-6、TNF-α、IL-1β及TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)有不同程度的減少(P<0.01)，而高劑量組IL-6、TNF-α、IL-1β下降的幅度高于低劑量組(P<0.05)。見圖5。

圖5 THP-1巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β及TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)Fig.5 Expression of IL-6,TNF-α,IL-1β and TLR4,MyD88 and NF-κB in THP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerarin group;D.High-dose of puerarin group;Group A,C,D compared with group B,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.5TLR4、 MyD88、 NF-κB蛋白表達(dá) oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞能上調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)(P<0.01)；與oxLDL組比較，葛根素低、高劑量不同程度下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)(P<0.05)，而高劑量組下調(diào)幅度高于低劑量組(P<0.05)。見圖6、7。

圖6 THP-1巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)Fig.6 Expression of TLR4,MyD88 and NF-κB in THP-1 macrophages

圖7 THP-1巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB相對表達(dá)Fig.7 Relative expression of TLR4,MyD88 and NF-κB in THP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerarin group;D.High-dose of puerarin group;Group A,C,D compared with group B,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.6細(xì)胞免疫熒光對TLR4、MyD88、NF-κB定位 以熒光染色對細(xì)胞定位可見，TLR4表達(dá)于細(xì)胞膜，MyD88表達(dá)于胞質(zhì)，NF-κB表達(dá)于胞核。oxLDL刺激后THP-1巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88和NF-κB熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而葛根素低、高劑量組TLR4、MyD88和NF-κB熒光強(qiáng)度有不同程度減弱，且葛根素高劑量組降低的幅度更大。見圖8～10。

圖8 THP-1巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)定位Fig.8 Expression of TLR4 in THP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerarin group;D.High-dose of puerarin group.

圖9 THP-1巨噬細(xì)胞MyD88表達(dá)定位Fig.9 Expression of MyD88 in THP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerarin group;D.High-dose of puerarin group.

圖10 THP-1巨噬細(xì)胞NF-κB表達(dá)定位Fig.10 Expression of NF-κB inTHP-1 macrophagesNote:A.Control group;B.oxLDL group;C.Low-dose of puerarin group;D.High-dose of puerarin group.

3 討論

動脈粥樣硬化是以炎癥浸潤、氧化應(yīng)激反應(yīng)及激活免疫應(yīng)答為特征的慢性炎癥性血管病。在AS早期，血液中的單核細(xì)胞在P-選擇素、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)等趨化因子作用下向病變位置內(nèi)膜遷移并通過內(nèi)皮間隙到達(dá)皮下組織，分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)的清道夫受體攝取oxLDL，活化的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、活性氧和基質(zhì)蛋白酶等。但是由于oxLDL大量產(chǎn)生超過機(jī)體清除范圍，持續(xù)沉積導(dǎo)致巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞并形成脂池，最終形成AS斑塊[12，13]。中藥葛根素被證實(shí)在心絞痛、心力衰竭、心肌缺血等心血管疾病治療方面具有保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究葛根素通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

巨噬細(xì)胞是兼有促炎與抗炎功能的異質(zhì)性細(xì)胞群，在不同的刺激下向M1型或M2型轉(zhuǎn)化。M1型(經(jīng)典激活型)具有促炎功能，分泌炎性因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，M2型(替代激活型)具有抗炎功能，釋放多種抗炎介質(zhì)，參與組織修復(fù)，與心血管疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，AS形成的部位存在大量M1型巨噬細(xì)胞浸潤，并在oxLDL的慢性刺激下轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞(AS標(biāo)志性細(xì)胞)，促進(jìn)脂質(zhì)顆粒沉積形成斑塊，導(dǎo)致血管狹窄[14]。本研究結(jié)果顯示oxLDL作用下的THP-1巨噬細(xì)胞能提高M(jìn)1型巨噬細(xì)胞重要標(biāo)志因子IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA水平。而低、高劑量葛根素的干預(yù)能抑制oxLDL介導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，提示葛根素或通過抑制M1型巨噬細(xì)胞促炎作用，或促進(jìn)M1型向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，進(jìn)而發(fā)揮抗炎功能，減緩AS慢性炎癥反應(yīng)過程及斑塊形成進(jìn)展。魏群[15]、周鳳華[16]等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明葛根素能抑制AS斑塊形成，明顯延緩AS病變進(jìn)展，此作用可能與葛根素下調(diào)AS進(jìn)程中的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Katsargyris等[17，18]報(bào)道AS斑塊中TLR4強(qiáng)表達(dá)，用TLR4激活劑可誘導(dǎo)AS斑塊形成及血管重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，oxLDL作用下的THP-1巨噬細(xì)胞上調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平。研究表明CD36和oxLDL共同作用能促進(jìn)巨噬細(xì)胞輔助受體TLR4和TLR6復(fù)合物形成，進(jìn)而誘導(dǎo)下游氧化還原分子活化，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，活化巨噬細(xì)胞并釋放炎性細(xì)胞因子。刁文晶[19]研究證實(shí)葛根素通過TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎功效，誘導(dǎo)結(jié)腸癌sw480細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，抑制癌癥的進(jìn)展。本研究顯示葛根素可降低oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)上調(diào)，通過下調(diào)TLR4-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞活化，對AS形成發(fā)揮抑制作用。結(jié)合炎性細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見葛根素作為具有抗氧化效應(yīng)的異黃酮類化合物能夠有效降低oxLDL誘導(dǎo)的TLR4-NF-κB通路的活化狀態(tài)，進(jìn)而下調(diào)IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和抗AS功效。由于在脂質(zhì)的形成、斑塊的形成及破裂等AS發(fā)展進(jìn)程中炎性細(xì)胞因子發(fā)揮主導(dǎo)性作用。因此，葛根素靶向作用于抗炎通路TLR4-NF-κB，直接抑制炎性因子的產(chǎn)生，發(fā)揮的抗AS作用針對慢性炎癥本身，作用更直接有效。本文為動脈粥樣硬化患者提供潛在的治療方法，為葛根素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。葛根素心血管保護(hù)的細(xì)胞及分子機(jī)制，尤其是藥物作用的靶位點(diǎn)，仍有待進(jìn)一步深入研究。