林道冠 徐桂麗

(三亞市人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，三亞 572000)

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種同時影響軟骨及鄰近組織的退行性疾病，膝骨關節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是OA的最常見類型，并伴有軟骨下骨板、關節(jié)邊緣骨質(zhì)增生及局部炎癥等臨床癥狀[1]。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞成分，軟骨細胞的老化、凋亡在關節(jié)軟骨的維持、再建、塑形、更新中起重要的作用[2]。流行病學調(diào)查結果顯示，KOA的病因可能與包括遺傳、軟骨代謝、炎癥和免疫調(diào)節(jié)紊亂等在內(nèi)的一些風險因素有關[3]。近年來，microRNAs因其在基因轉錄過程中的重要作用而備受關注，其已逐步成為一種新的生物標志物，在KOA的早期診斷中發(fā)揮重要作用[4]。TLR4/NF-κB信號通路已被證明在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中起促進作用[5]。針灸療法屬于中醫(yī)外治法，包括針法和灸法，其治療機制多與刺激腧穴、調(diào)動經(jīng)絡及通調(diào)臟腑氣血有關[6]。近些年，針灸治療KOA的實驗研究多見且臨床療效顯著，但其具體作用機制尚未闡明。因此本研究采用大鼠KOA模型探究單一針灸及針灸聯(lián)合miRNA-30b-5p-mimics或siRNA-TLR4治療的療效，旨在為針灸治療KOA提供更科學、嚴謹?shù)睦碚摶A。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器 ①主要試劑：大鼠TNF-α(No.PT518)、IL-1β(No.PI303)、IL-6(No.PI303)ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；大鼠MMP-13(No.RA20501)ELISA試劑盒購自中國Bio-Swamp公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；SYBR Green染料購自Lumiprobe Corporation公司；全蛋白提取、BCA蛋白濃度檢測試劑盒及高靈敏ECL化學放光試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司；兔抗TLR4抗體(No.19811-1-AP；稀釋比：1∶500)、兔抗NF-κB抗體(No.14220-1-AP；稀釋比：1∶500)、兔抗IL-6抗體(No.21865-1-AP；稀釋比：1∶1 000)、兔抗MMP-13抗體(No.18165-1-AP；稀釋比：1∶1 000)、兔抗GAPDH抗體(No.10494-1-AP；稀釋比：1∶2 500)購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔二抗IgG(No.ab97051；稀釋比：1∶5 000)購自英國Abcam公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)(No.PAB180028)購自中國Bio-Swamp公司；艾條購自南京同仁堂藥業(yè)有限公司(國藥準字Z32020034)；脂質(zhì)體2000和HEK-293T細胞購自美國Thermo Fisher Scientific；pGL3雙熒光素酶報告載體由廣州銳博生物科技有限公司提供；其余常見試劑均購自國藥集團。②主要儀器：華佗牌針灸針購自蘇州市南方醫(yī)療器械有限公司；熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD；全自動化學發(fā)光分析儀購自上海天能；凝膠處理分析系統(tǒng)購自美國ABI；低溫冷凍離心機購自德國Eppendorf；酶標儀購自美國Bio-Tek。

1.1.2實驗動物 40只雄性SPF級Wistar大鼠(200±20)g購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2013-0004。動物室內(nèi)環(huán)境溫度為21±2℃，濕度(50±15)%，12 h明暗交替，自由飼養(yǎng)，暫養(yǎng)一周后開始實驗。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及大鼠KOA模型構建 采用隨機數(shù)字分組法將暫養(yǎng)一周后的40只大鼠平均分成5組(n=8)：正常組、模型組、單一針灸治療組、針灸+miRNA-9-5p-mimics聯(lián)合治療組以及針灸+siRNA-TLR4聯(lián)合治療組。其中模型組、單一針灸組和聯(lián)合治療組大鼠均進行KOA模型構建。大鼠KOA模型構建：采用經(jīng)改良后的Videman法[7]，左后肢伸直位固定制動法進行造模，6周時從各組動物隨機抽取1只處死，取關節(jié)軟骨作病理觀察，驗證造模是否成功。

1.2.2治療方法 ①正常組與模型組：正常飼養(yǎng)，不給予任何治療。②單一針灸治療組：造模成功1周后，采用華佗牌針灸針(0.30 mm×40 mm)，選取“足三里”穴、“陽陵泉”穴垂直入針，入針后均施捻轉，中度刺激，之后在針柄上插入2 cm的艾條，燃盡。每次留針30 min，每天1次，1周為1個療程，中間休息2 d，共治療4周(療程)。③聯(lián)合治療組：siRNA-TLR4和miR-30b-5p mimics均由廣州銳博生物科技有限公司代為設計、合成并提供。此部分大鼠在單一針灸治療的基礎上，每周額外膝關節(jié)腔內(nèi)注射10 μg/只miRNA-30b-5p-mimics或siRNA-TLR4，共注射4次，直至治療結束。

1.2.3樣本采集 治療結束后，采用40 mg/kg腹腔注射戊巴比妥溶液，大鼠麻醉后腹主動脈放血致死；收集每組8只大鼠的膝關節(jié)滑膜液備檢；取部分膝關節(jié)軟骨組織，10%中性福爾馬林溶液固定備用；剩余部分軟骨組織-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4病理學變化檢測(HE染色) 取經(jīng)固定后的各組大鼠部分膝關節(jié)軟骨組織，依次經(jīng)過：①常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋；②切片：4 μm左右；③展片和烤片；④HE染色；⑤中性樹膠封片；⑥拍照分析；確認并比較各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織病理學變化。

1.2.5膝關節(jié)滑膜液TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13的分泌水平檢測 分別依照大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13 ELISA檢測試劑盒使用說明書操作，檢測各組大鼠膝關節(jié)滑膜液TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13的分泌水平。

1.2.6qRT-PCR檢測軟骨組織中miRNA-30b-5p、TLR4和NF-κB的表達水平 根據(jù)NCBI上公布的大鼠各基因序列分別設計qRT-PCR用引物：miRNA-30b-5p F/R：5′-CACCAGCCATGTAAACATC-C-3′，5′-ATGCTTGTTCTCGTCTCTGT-3′；TLR4 F/R：5′-CCAGAGCCGTTGGTGTATC-3′，5′-TCAAGGCTTT-TCCATCCAAC-3′；NF-κB F/R：5′-GACAGCACCACCTACGAT-3′，5′-GGATCACTTCAATGGCCT-3′;GA-PDH F/R：5′-CAAGCAACTGTCCCTGAG-3′，5′-TAG-ACAGAAGGTGGCACA-3′及U6 F/R：5′-ATTGG-AACGATACAGAGAAG-3′，5′-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3′；并由上海生物工程有限公司代為合成。分別提取各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織RNA，反轉錄成cDNA單鏈為模板，采用20 μl PCR反應體系：各基因對應上下游引物各0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，cDNA模板1.0 μl，滅菌雙蒸水8 μl。PCR反應程序：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 25 s，35個循環(huán)；65℃ 5 min；95℃ 50 s，選取GAPDH或U6為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCT表示基因的相對表達量。

1.2.7Western blot檢測軟骨組織中TLR4、NF-κB、IL-6和MMP-13蛋白表達量 采用組織全蛋白提取試劑盒對各組大鼠軟骨組織進行蛋白提??；然后用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對所提蛋白進行濃度檢測；緊接著取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗(TLR4、NF-κB、IL-6和MMP-13)在4℃下，孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學發(fā)光法進行顯色；以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.2.8軟骨組織中軟骨細胞凋亡檢測(TUNEL染色) 取經(jīng)固定后的各組大鼠部分膝關節(jié)軟骨組織，依次經(jīng)過：①常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋；②切片：5 μm 左右；③烤片和脫蠟；④TUNEL染色；⑤中性樹膠封片；⑥光鏡下拍照、分析；確認并比較各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中軟骨細胞的凋亡情況。

1.2.9雙熒光素酶報告試驗驗證miRNA-30b-5p與TLR4的靶向關系 首先，采用PCR擴增法獲得大鼠TLR4基因3′非編碼區(qū)(3′UTR)片段，然后通過雙酶切法將TLR4基因3′UTR插入pGL3雙熒光素酶報告載體獲得TLR4 3′UTR野生型；同時合成TLR4 3′UTR突變片段，并插入pGL3雙熒光素酶報告載體構建TLR4 3′UTR突變型；然后采用脂質(zhì)體2000將TLR4 3′UTR野生型/突變型和miR-30b-5p mimics/NC轉染進1.0×106個/孔的HEK-293T細胞中；轉染48 h后，采用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)檢驗各組細胞的熒光素酶活性。

2 結果

2.1大鼠膝關節(jié)軟骨組織病理學變化 HE染色結果顯示(圖1)，正常組大鼠膝關節(jié)軟骨組織結構正常，軟骨細胞數(shù)目較多，排列整齊；模型組大鼠軟骨組織結構層次不清，軟骨層薄而粗糙，細胞數(shù)目少，排列散亂，潮線斷裂，出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤；與模型組比較，單一針灸組及聯(lián)合治療組大鼠軟骨組織結構尚清晰可見，軟骨細胞稍增多，排列尚整齊，潮線趨于完整，炎性細胞浸潤減少。

2.2ELISA檢測滑膜液TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13的分泌水平 ELISA檢測結果顯示(表1)，與正常組比較，模型組大鼠滑膜液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13的分泌水平均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，單一針灸組及聯(lián)合治療組大鼠滑膜液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13的分泌水平均顯著降低(P<0.01)；與單一針灸組比較，聯(lián)合治療組大鼠滑膜液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13分泌水平均顯著降低(P<0.05；P<0.01)。

2.3軟骨組織中miRNA-30b-5p、TLR4和NF-κB在mRNA水平上的表達 qRT-PCR檢測結果顯示(圖2)，與正常組比較，模型組大鼠軟骨組織miRNA-30b-5p表達顯著降低(P<0.01)，而TLR4和NF-κB表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，針灸組及聯(lián)合治療組miRNA-30b-5p表達顯著升高(P<0.01)，而TLR4和NF-κB表達顯著降低(P<0.01)；與針灸組比較，針灸聯(lián)合miRNA-30b-5p-mimics治療組miRNA-30b-5p表達顯著升高(P<0.01)，TLR4和NF-κB表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)；而針灸聯(lián)合siRNA-TLR4治療組miRNA-30b-5p表達無顯著變化，而TLR4和NF-κB表達顯著降低(P<0.01)。

圖1 軟骨組織病理學變化檢測(HE染色,×400)Fig.1 Detection of chondral histopathological changes(HE staining,×400)

表1 滑膜液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP-13的分泌水平比較

Tab.1 Comparison of secretion levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and MMP-13 in synovial fluid

Group(n=8)TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)MMP-13(pg/ml)Control88.59±15.2656.78±8.6066.21±12.35101.26±13.25KOA model267.48±32.561)195.24±17.481)248.90±35.681)315.23±30.441)ACU184.26±26.242)134.56±12.242)187.59±16.212)214.48±17.592)ACU+miR-30b-5p mimics132.56±15.262)4)102.34±9.112)3)123.24±11.262)4)178.22±14.632)3)ACU+siRNA-TLR4128.22±16.042)4)89.31±8.472)4)106.92±10.242)4)152.31±13.882)4)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with KOA model group,2)P<0.01;compared with ACU group,3)P<0.05,4)P<0.01.

圖2 各基因mRNA水平表達檢測Fig.2 Detection of each gene mRNA level expressionNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with KOA model group,##.P<0.01;compared with ACU group,&.P<0.05,&&.P<0.01.

2.4軟骨組織中TLR4、NF-κB、IL-6和MMP-13蛋白表達量 Western blot檢測結果顯示(圖3)，與正常組比較，模型組大鼠軟骨組織TLR4、NF-κB、IL-6和MMP-13表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，針灸組及聯(lián)合治療組TLR4、NF-κB、IL-6和MMP-13表達顯著降低(P<0.01)；與針灸組比較，針灸聯(lián)合miRNA-30b-5p-mimics及siRNA-TLR4治療組TLR4、NF-κB、IL-6和MMP-13表達不同程度降低(P<0.05，P<0.01)。

圖3 各基因蛋白水平表達檢測Fig.3 Detection of each gene protein level expressionNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with KOA model group,##.P<0.01;compared with ACU group,&.P<0.05,&&.P<0.01.

2.5TUNEL染色檢測軟骨組織中軟骨細胞凋亡情況 TUNEL染色結果顯示(圖4)，與正常組比較，模型組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中凋亡的軟骨細胞明顯增多；與模型組比較，單一針灸組和聯(lián)合治療組大鼠軟骨細胞的凋亡現(xiàn)象顯著減輕，凋亡細胞明顯減少，其中聯(lián)合治療組大鼠軟骨細胞凋亡現(xiàn)象減輕更顯著。

圖4 軟骨細胞凋亡檢測(TUNEL染色，×400)Fig.4 Detection of chondrocyte apoptosis(TUNEL staining,×400)

2.6miRNA-30b-5p與TLR4的靶向關系預測及驗證 miRDB在線數(shù)據(jù)庫預測結果顯示(圖5A)，TLR4為miRNA-30b-5p的潛在靶基因；雙熒光素酶報告試驗結果顯示(圖5B)，與轉染了TLR4 3′UTR野生型的miRNA-30b-5p-NC組比較，轉染了miRNA-30b-5p-mimics組的細胞熒光強度顯著降低(P<0.01)。

圖5 miRNA-30b-5p與TLR4的靶向關系預測及驗證Fig.5 Prediction and verification of targeted relationship between miRNA-30b-5p and TLR4Note:Compared with miRNA-30b-5p-NC in same group,**.P<0.01.

3 討論

膝骨關節(jié)炎(KOA)是一種以關節(jié)軟骨退變或破壞，伴有軟骨下骨板、關節(jié)邊緣骨質(zhì)增生為主要病理變化的退行性關節(jié)病。該病始發(fā)部位在關節(jié)軟骨，以老年人群最為常見，其癥狀是以關節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙為主，60歲以上的人群中患病率可達50%，75歲以上的人群則達80%[8]。目前臨床上對膝骨關節(jié)炎的治療尚沒有特效或治愈的方法，其治療主要在于緩解臨床癥狀。因此，尋求治療KOA的有效手段，延緩本病的進展，改善其臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量，已成為目前預防保健和臨床治療研究的重點。

中醫(yī)學認為KOA屬于“痹癥”范疇，其病因病機是由于機體肝腎虧虛，氣血不足，感受風寒濕邪，筋脈閉阻，氣血不暢，積久而發(fā)；該病以正虛為本，邪實為標[9]。針灸作為祖國醫(yī)學的傳統(tǒng)療法，目前其治療KOA仍以臨床觀察為主，治療方法上主要針對痹癥風濕寒淤及本虛的特點，采取祛風散寒除濕、活血化瘀通絡的治療措施。例如，梁超等[10]選取溫針灸配合新型膝關節(jié)針灸箱治療KOA患者，發(fā)現(xiàn)治療總有效率及各癥狀評價變化率顯著高于西藥組。岳萍等[11]在兔KOA模型相關研究中發(fā)現(xiàn)，選用“內(nèi)膝眼”“犢鼻”“血海”及“陽陵泉”等穴位進行溫針灸干預能顯著降低關節(jié)軟骨中TNF-α、MMP-3水平，發(fā)揮抗炎作用?！白闳铩毖ㄊ亲汴柮魑附?jīng)之合穴，是對胃腑有直接作用的腧穴；而“陽陵泉”穴為八脈交會之筋會，有祛風散寒除濕，舒經(jīng)通絡之效[12]。本研究選取“足三里”及“陽陵泉”穴入針，結果發(fā)現(xiàn)能顯著緩解KOA大鼠的膝關節(jié)軟骨損傷，抑制炎癥反應，且下調(diào)軟骨組織中軟骨細胞的凋亡水平。

TLR4/NF-κB信號通路是典型的炎癥反應調(diào)節(jié)信號之一，TLR4的活化可以進一步增加NF-κB的表達量，進而引起下游炎癥因子的轉錄調(diào)節(jié)，促使炎癥反應發(fā)生。研究顯示，TLR4/NF-κB信號通路參與KOA的發(fā)生、發(fā)展。例如，對因KOA而進行了膝關節(jié)置換術患者的關節(jié)軟骨進行檢測時發(fā)現(xiàn)，負重區(qū)軟骨中TLR4及NF-κB的mRNA及蛋白表達量異常升高，提示TLR4/NF-κB信號通路介導的自身免疫可能參與了KOA的發(fā)病機制[13]。而通過藥物或其他療法靶向抑制TLR4/NF-κB信號已成為治療KOA的有效途徑。例如，白藜蘆醇可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗KOA效應[14]。而經(jīng)筋微創(chuàng)療法不僅能有效提升KOA患者的臨床療效；還能抑制KOA模型兔TLR4及下游MyD88、NF-κB的表達，阻斷炎性細胞因子的分泌，減少軟骨破壞，改善關節(jié)活動功能障礙、晨僵等癥狀，從而達到控制疾病進一步發(fā)展的目的[15]。上述結果表明，靶向抑制TLR4/NF-κB信號通路能有效緩解KOA的炎癥反應，抑制KOA的發(fā)展進程。

近年來，miRNAs在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用已成為研究熱點。miRNA是一種非編碼的小分子RNA，在基因的表達調(diào)控過程中起著非常重要的作用，其常規(guī)作用方式是通過與靶基因的3′UTR結合抑制靶基因的表達。miR-30家族不僅與癌癥、腎小球疾病以及心肌肥大等疾病發(fā)生密切相關還被證明在成骨細胞分化過程中扮演著重要的負調(diào)節(jié)作用[16]。此外，miR-30家族成員還被證明在氣管軟骨細胞中高表達，且調(diào)控著軟骨細胞的分化[17]。而miR-30家族在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中的研究還比較少見。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，在KOA大鼠膝關節(jié)軟骨中，miR-30b-5p呈顯著低表達，而TLR4及NF-κB呈異常高表達，我們猜測miR-30b-5p可能通過靶向調(diào)控TLR4/NF-κB進而促進KOA的進程，而這種關系可能通過針灸療法而被逆轉。因此，我們通過針灸聯(lián)合miR-30b-5p-mimics或干擾miR-30b-5p的預測靶基因TLR4的表達來觀察KOA大鼠的改善情況；結果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合療法的作用效果優(yōu)于單一針灸療法，提示針灸可能通過上調(diào)miR-30b-5p的表達進而抑制TLR4/NF-κB信號通路對KOA的影響。

綜上所述，針灸治療KOA模型大鼠具有顯著療效，其作用途徑可能是通過調(diào)控miR-30b-5p/TLR4/NF-κB信號軸的表達，進而降低軟骨細胞凋亡和炎癥因子分泌來實現(xiàn)的，其對KOA大鼠的損傷修復具有積極作用。這為針灸治療KOA提供了更加系統(tǒng)的科學理論，為后期針灸聯(lián)合分子靶向療法治療KOA奠定基礎。