賀 攀 趙肅清 楊慧怡 余林金 盧明磊 魏秀婷

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510006)

伴放線聚集桿菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans,Aa)是青少年局限型侵襲性牙周炎的主要致病菌[1]。嚴(yán)重的牙周炎可導(dǎo)致咀嚼受損、牙根暴露、牙齒松動(dòng)、牙齒脫落等癥狀[2]。目前主流的治療方法是聯(lián)合使用基礎(chǔ)治療(如潔治、刮治、根面平整等)和抗生素[3]，但濫用抗生素導(dǎo)致耐藥細(xì)菌株的出現(xiàn)已成為一個(gè)全球性問(wèn)題[4,5]。亟需尋找新的治療方法。

卵黃抗體(Egg yolk antibody,IgY)是禽類血清中的主要免疫球蛋白，產(chǎn)蛋禽類經(jīng)特異性抗原免疫后，所產(chǎn)生的特異性卵黃抗體可以從血液中轉(zhuǎn)移至卵黃中富集。卵黃抗體具有靶向性強(qiáng)、副作用低、無(wú)污染、無(wú)需采血、易于大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種病原微生物疾病的預(yù)防和治療[6]。在口腔方面，通過(guò)口服被動(dòng)免疫途徑，抗具核梭桿菌和中間普氏菌的特異性卵黃抗體被用于治療牙周疾病[7,8]，具有代替抗生素的潛力[9]。因此，本研究制備抗伴放線聚集桿菌卵黃抗體，研究其體外生物活性，為預(yù)防和治療牙周疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 伴放線聚集桿菌(ATCC 29523,GIM 1.393)購(gòu)買(mǎi)于廣東省微生物菌種保存中心。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6只20周齡的健康產(chǎn)蛋母雞，飼養(yǎng)于廣州太和良田良沙養(yǎng)雞廠。

1.1.3培養(yǎng)基 血平板瓊脂培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基。

1.1.4主要試劑和儀器 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑 (Sigma,美國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞二抗(EarthOx,美國(guó))；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的驢抗雞二抗 (上海生工生物工程有限公司)；抗熒光淬滅封片劑 (北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。超濾膜包 (Sartorius,德國(guó))；真空冷凍干燥機(jī) (北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；酶標(biāo)分析儀 (Thermo scientific MultiskanTMFC,美國(guó))；倒置熒光顯微鏡 (Olympus IX71,日本)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)伴放線聚集桿菌 將伴放線聚集桿菌接種在血平板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h (37℃，5% CO2)，從固體培養(yǎng)基中接種細(xì)菌至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，離心 (4℃，6 000 r/min，10 min) 收集沉淀并用PBS溶液洗滌3次。

1.2.2制作抗原與免疫蛋雞 抗原的制作按照Xu等[10]的實(shí)驗(yàn)方案并稍作修改。往伴放線聚集桿菌沉淀中加入0.5%的甲醛溶液并混勻，4℃過(guò)夜滅活，用PBS溶液洗滌3次，調(diào)節(jié)伴放線聚集桿菌懸液濃度至1×109CFU/ml。菌懸液與等體積的弗氏佐劑混合，乳化充分后，采用肌肉注射方式免疫產(chǎn)蛋母雞，每隔9 d免疫1次，共8次。初次免疫使用弗氏完全佐劑，后7次加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑。第2次免疫后收集雞蛋，連續(xù)收集3個(gè)月，并按照天數(shù)進(jìn)行編號(hào)，取未免疫母雞的雞蛋作為陰性對(duì)照。

1.2.3卵黃抗體的分離與純化 參考Xu等[10]實(shí)驗(yàn)方案提取卵黃抗體并稍作修改。酒精消毒雞蛋，破殼并用蛋清分離器分離蛋清與卵黃。收集卵黃液并量取體積，向卵黃液中加入9倍其體積的雙蒸水 (pH5.0～5.2) 進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后，于4℃靜置過(guò)夜。離心 (4℃,10 000 r/min,15 min) 收集上清液，用濾紙過(guò)濾，得到水溶性卵黃抗體提取物。然后向提取物中加入飽和硫酸銨溶液使其飽和度達(dá)到50%，離心 (4℃,8 000 r/min,20 min) 收集沉淀。繼續(xù)加入3倍卵黃液體積的19%硫酸鈉溶液，離心 (4℃,8 000 r/min,20 min) 收集沉淀。將沉淀溶于PBS溶液，用50 kD膜包超濾，最后用冷凍真空干燥機(jī)干燥成粉末，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 采用SDS-PAGE凝膠電泳 (5%的濃縮膠，10%的分離膠) 分析卵黃抗體的相對(duì)分子量和純度[11]。

1.2.5間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)抗體效價(jià) ELISA實(shí)驗(yàn)綜合參考了Li等[12]和韋傳寶等[13]的實(shí)驗(yàn)方法并稍作修改。用碳酸鹽包被緩沖液 (CBS，pH9.6，0.05 mol/L) 將伴放線聚集桿菌懸液稀釋至3×107CFU/ml，包被于96孔酶標(biāo)板，100 μl/孔，4℃包被過(guò)夜，傾倒液體，用PBST溶液 (含有0.05%吐溫-20的PBS) 洗板3次，用吸水紙拍干酶標(biāo)板后。加入3%的脫脂奶粉溶液封閉(100 μl/孔)，37℃孵育1 h，如上洗滌拍板操作后。對(duì)特異性卵黃抗體 (1 mg/ml,1∶10) 進(jìn)行倍比稀釋，用非特異性卵黃抗體作為陰性對(duì)照， 37℃孵育1 h，傾倒酶標(biāo)板孔中液體，如上洗滌拍板操作后。每孔加入100 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞二抗溶液 (1∶5 000)，37℃孵育1 h，然后甩干孔中液體，如上洗滌拍干操作后。加入現(xiàn)配的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 顯色液 (100 μl/孔)，37℃孵育15 min，用濃度為2 mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng) (50 μl)。檢測(cè)450 nm處的吸光值 (OD)。以陽(yáng)性孔OD值≥2.1倍陰性孔OD值時(shí)的最大稀釋倍數(shù)作為特異性卵黃抗體的效價(jià)。

1.2.6間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體的特異性 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)綜合參考了Li等[14]和向江艷等[15]的實(shí)驗(yàn)方法并稍作修改。將3×107CFU/ml伴放線聚集桿菌懸液與等體積含1%牛血清白蛋白的PBS緩沖溶液和特異性卵黃抗體溶液(10 μg/ml)、非特異性卵黃抗體(10 μg/ml)進(jìn)行混合。在37℃下孵育 1 h，離心 (4℃,8 000 r/min,10 min) 收集細(xì)菌沉淀，洗滌3次后。加入100 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記的驢抗雞二抗溶液(1∶100)，在37℃下孵育1 h，洗滌3次后，洗滌樣品并重懸于50 μl溶液中。然后，取少量懸浮液滴加至載玻片上，于陰暗環(huán)境下風(fēng)干，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋好蓋玻片。最后用倒置熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象。

1.2.7細(xì)菌凝集試驗(yàn) 細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)按照Qin等[16]的實(shí)驗(yàn)方法并稍作修改。在超凈工作臺(tái)上，將特異性卵黃抗體溶液、非特異性卵黃抗體溶液以及PBS溶液全部用水系0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌。然后，將血平板上培養(yǎng)24 h的伴放線聚集桿菌用接種環(huán)轉(zhuǎn)移至無(wú)菌PBS中，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1×108CFU/ml，伴放線聚集桿菌懸液分別與等體積特異性卵黃抗體溶液(0.5 mg/ml)、非特異性卵黃抗體溶液(0.5 mg/ml)、PBS溶液在孔中混合，室溫下作用1 h后，在顯微鏡下觀察菌群的凝集現(xiàn)象。

1.2.8抑制伴放線聚集桿菌生物被膜的形成 用結(jié)晶紫染色定量法分析細(xì)菌生物被膜形成的量，參考Xu等[8]的實(shí)驗(yàn)方案并稍微修改。用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)伴放線聚集桿菌，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至6×107CFU/ml，分別與等體積過(guò)濾除菌的特異性卵黃抗體溶液(2、4、8 mg/ml)、非特異性卵黃抗體溶液(8 mg/ml)、氨芐青霉素溶液(0.1 mg/ml)以及PBS溶液混合。然后，將100 μl不同組的混合液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組做3個(gè)平行， 37℃培養(yǎng)24 h后，傾倒培養(yǎng)物。用蒸餾水漂洗培養(yǎng)板2次，用 50 μl濃度為0.5%結(jié)晶紫染色15 min，洗滌3次后，用200 μl濃度為95%的乙醇溶解結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀測(cè)孔中溶液的OD595 nm。

2 結(jié)果

2.1SDS-PAGE凝膠電泳 卵黃抗體的SDS-PAGE如圖1所示，卵黃抗體在沸水浴和二硫蘇糖醇(DTT)作用下，二硫鍵打開(kāi)，裂解成分子量約為70 kD 的重鏈和25 kD的輕鏈，與理論一致。從圖 1中還可以觀察到，水稀釋提取的卵黃抗體含有較多的雜質(zhì)蛋白，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析、硫酸鈉鹽析純化后，抗體純度得到提高，基本無(wú)明顯雜質(zhì)蛋白條帶。超濾凍干后的抗體電泳圖與超濾前基本一致，這與Xu等[8]實(shí)驗(yàn)報(bào)道相似。

圖1 卵黃抗體的SDS-PAGE分析Fig.1 IgY was analyzed by SDS-PAGENote:M.Marker;1.Water-soluble fractions;2.Fractions collected after (NH4)2SO4 precipitation;3.Fractions collected after Na2SO4 precipitation;4.IgY from freeze-dried powder.

2.2間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)變化 卵黃抗體效價(jià)隨時(shí)間的變化如圖2所示，初次免疫5次后，抗體的效價(jià)迅速升高，特異性卵黃抗體效價(jià)達(dá)到峰值(1∶10 240)，并持續(xù)30 d。然后抗體效價(jià)開(kāi)始下降，實(shí)驗(yàn)表明特異性卵黃抗體能結(jié)合伴放線聚集桿菌。

圖2 抗伴放線聚集桿菌卵黃抗體的效價(jià)隨時(shí)間的變化Fig.2 Titer of anti-Aa IgY was changed after first immunization

2.3間接免疫熒光檢測(cè)抗體的特異性 熒光表示卵黃抗體與伴放線聚集桿菌陽(yáng)性結(jié)合。熒光強(qiáng)弱間接反映卵黃抗體與伴放線聚集桿菌的結(jié)合程度。從圖3A中看出，特異性卵黃抗體組熒光較強(qiáng)并且黃綠色熒光點(diǎn)數(shù)量較多，表明特異性卵黃抗體與伴放線聚集桿菌結(jié)合較強(qiáng)。而圖3B和圖3C中，熒光較弱，基本觀察不到熒光點(diǎn)。表明非特異性抗體和PBS溶液與伴放線聚集桿菌結(jié)合較弱或不結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明卵黃抗體與伴放線聚集桿菌的結(jié)合具有較強(qiáng)的特異性。

圖3 伴放線聚集桿菌與卵黃抗體結(jié)合的免疫熒光圖(×200)Fig.3 Specific binding activity of IgY against Aa was revealed by micrographs of indirect immunofluor-escence(×200)Note:A.Specific IgY;B.Nonspecific IgY;C.PBS.

2.4細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。圖4A中，特異性卵黃抗體能識(shí)別伴放線聚集桿菌，其菌群發(fā)生共凝集現(xiàn)象。圖4B和4C中，細(xì)菌分散比較均勻，無(wú)凝集現(xiàn)象。單個(gè)伴放線聚集桿菌個(gè)體微小，放大400倍不足以明顯看清，但在顯微鏡下能明顯地觀察到凝集成團(tuán)的伴放線聚集桿菌的菌群。這是卵黃抗體與伴放線聚集桿菌高特異性結(jié)合所致。

2.5卵黃抗體抑制伴放線聚集桿菌生物被膜的形成 用結(jié)晶紫染色定量法分析卵黃抗體對(duì)伴放線聚集桿菌形成生物被膜能力的影響。結(jié)果如表1所示，特異性卵黃抗體組的吸光值顯著小于(P<0.05)空白對(duì)照組(PBS溶液)和陰性對(duì)照組(非特異性抗體組)的吸光值，相對(duì)于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組來(lái)說(shuō)，特異性抗體組中，伴放線聚集桿菌的生物被膜形成量少。同時(shí)特異性卵黃抗體組中生物被膜形成的量與其濃度有關(guān)，濃度高，吸光值小，形成生物被膜少。這說(shuō)明特異性卵黃抗體以劑量依賴性的方式抑制伴放線聚集桿菌生物被膜的形成。

圖4 伴放線聚集桿菌與卵黃抗體作用的凝集圖(×400)Fig.4 Specific IgY acted on Aa was revealed by photomicrographs of microbial agglutination assay(×400)Note:A.Specific IgY;B.Nonspecific IgY;C.PBS.

表1 特異性卵黃抗體抑制伴放線聚集桿菌形成生物被膜

Tab.1 Inhibition effect of specific IgY on biofilm formation ofAa

TreatmentsOD595 nmAa+PBS0.580±0.0601)Aa+8 mg/ml specific IgY0.224±0.0102)Aa+4 mg/ml specific IgY0.244±0.0062)3)Aa+2 mg/ml specific IgY0.291±0.0183)4)Aa+8 mg/ml nonspecific IgY0.443±0.0285)Aa+0.1 mg/ml ampicillin0.150±0.0036)

3 討論

侵襲性牙周炎的病因包括牙菌斑微生物及造成其滯留的局部因素、機(jī)體防御能力缺陷的全身因素、遺傳因素等[17]。伴放線聚集桿菌是牙菌斑微生物中的主要牙周致病菌之一[1]。本研究的主要目的在于制備抗伴放線聚集桿菌的卵黃抗體，為牙周炎的治療尋找新方法。

卵黃抗體的提取方法有水稀釋提取法、聚乙二醇沉淀法、硫酸葡聚糖沉淀法等[18]。水稀釋法獲得抗體的產(chǎn)量和純度較高，大規(guī)模生產(chǎn)的可能性和應(yīng)用的方便性也優(yōu)于其他方法[19]。本文采用水稀釋法提取卵黃抗體，粗提取的卵黃抗體含較多雜質(zhì)蛋白條帶，進(jìn)一步采用鹽析和超濾處理，凍干后的卵黃抗體基本無(wú)明顯雜質(zhì)蛋白條帶，說(shuō)明抗體的純度得到了提高。此外，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示卵黃抗體與伴放線聚集桿菌結(jié)合具有較強(qiáng)的特異性。卵黃抗體能特異性地識(shí)別伴放線聚集桿菌，引起菌群產(chǎn)生共凝集現(xiàn)象，這種特異性結(jié)合作用可能會(huì)減少細(xì)菌的活動(dòng)，抑制細(xì)菌黏附于牙周組織。

近年來(lái)，卵黃抗體被應(yīng)用于牙周疾病的被動(dòng)免疫治療，具有代替抗生素治療的潛力。Xu等[8]使用具核梭桿菌免疫母雞制備的抗具核梭桿菌卵黃抗體，能減少昆明鼠牙槽骨的損失。Hou等[7]用滅活中間普氏菌免疫產(chǎn)蛋母雞，獲得特異性卵黃抗體能有效抑制中間普氏菌生長(zhǎng)，保護(hù)大鼠免受中間普氏菌引起的牙齦炎。在口腔中，多種微生物以生物被膜的形式黏附在牙齒、牙齦、口腔黏膜的表面或內(nèi)部等部位，其中黏附于牙表面的生物被膜被稱之為牙菌斑[4]。牙菌斑為口腔微生物的生長(zhǎng)提供有利的條件，不僅能抵擋液體(比如水)的沖刷，還能增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力和降低細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[3]。牙菌斑還能為一些厭氧細(xì)菌定植提供條件，微生物之間的協(xié)同作用將促進(jìn)其生長(zhǎng)和繁殖[14]。在本研究中，特異性卵黃抗體顯著抑制伴放線聚集桿菌生物被膜的形成，破壞伴放線聚集桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境，可能有助于減少伴放線聚集桿菌黏附于牙周組織，減少其他種類微生物的定植，減少牙菌斑的形成。這表明卵黃抗體具有代替抗生素來(lái)防治牙周疾病的潛力。

本研究用伴放線聚集桿菌免疫產(chǎn)蛋母雞，通過(guò)水稀釋、硫酸銨沉淀、硫酸鈉沉淀等方法得到純度較高的卵黃抗體，卵黃抗體具有較高的效價(jià)和特異性。特異性卵黃抗體能促使伴放線聚集桿菌的菌群產(chǎn)生共凝集現(xiàn)象，有效抑制其形成生物被膜。研究成果為卵黃抗體被動(dòng)免疫治療牙周疾病提供理論依據(jù)，也為卵黃抗體大規(guī)模制備提供參考。