陳藝璇 唐相靖 崔金全

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450014)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent miscarriage，RM)是多種危險(xiǎn)因素相互作用的結(jié)果[1]。妊娠10周之前發(fā)生的RM通常稱為早期RM[2,3]。研究表明早期RM與妊娠期母胎界面免疫失衡及同種免疫功能紊亂相關(guān)，淋巴細(xì)胞作為重要的自身免疫細(xì)胞，在調(diào)節(jié)同種免疫功能中起到重要作用[4,5]。外周血淋巴細(xì)胞亞群增高與RM患者再次發(fā)生流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系存在爭議，因此給臨床診斷和治療造成困惑。本文回顧性研究了RM患者早孕期及非孕期外周血中淋巴細(xì)胞亞群百分比的變化，分析淋巴細(xì)胞亞群異常與早期RM患者妊娠結(jié)局的關(guān)系，探討其診斷及預(yù)測意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2017年1月至2018年8月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行診療的具有早期RM病史的患者153例作為觀察對(duì)象，其中87例早孕女性，年齡21～45歲，平均(31.69±5.53)歲，孕齡26～65 d，平均(48.29±14.25)d，孕次3～7歲，平均(4.14±1.14)次，早期自然流產(chǎn)2～6次，平均(2.74±0.98)次；66例未孕女性，年齡24～41歲，平均(31.99±5.06)歲，孕次2～9次，平均(3.55±1.90)次，早期自然流產(chǎn)2～6次，平均(3.33±1.59)次；選取同期至我院孕前體檢及圍產(chǎn)保健的110例既往無不良妊娠及生產(chǎn)史、無遺傳病家族史、無慢性病史的健康女性作為對(duì)照組，其中68例早孕女性，年齡23～42(30.99±4.67)歲，孕齡32～65 d，平均(50.88±11.22)d；42例未孕健康女性，年齡22～40歲，平均(30.52±4.74)歲。早期RM組納入標(biāo)準(zhǔn)：①同一性伴侶；②曾經(jīng)連續(xù)2次或2次以上孕齡<10周自然流產(chǎn)的病史；③就診時(shí)孕周<10周。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)陰道超聲或者宮腔鏡檢查確診子宮解剖結(jié)構(gòu)異常；②內(nèi)分泌異常：糖尿病、甲狀腺功能異常、多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥、高雄激素血癥；③自身免疫抗體陽性：抗核抗體及其提取物、抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白抗體、狼瘡凝集物、抗甲狀腺抗體；④凝血因子異常：蛋白C、蛋白S、抗凝血酶Ⅲ；⑤夫婦雙方染色體異常；⑥其他疾??；⑦男方精液及精子異常。觀察組與對(duì)照組在年齡、孕齡一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2檢測方法 取患者全血50 μl，加入等體積的溶血?jiǎng)?，離心后去上清，分別加入CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC、CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 抗體 20 μl (BD MultiTEST IMK Kit)，避光孵育15 min，加100 μl PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACSCaliburTM流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+細(xì)胞的比率。

2 結(jié)果

2.1妊娠結(jié)局 87例RM早孕患者中，50例在10周前發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)率57.47%；68例對(duì)照早孕女性中，24例在10周前發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)率35.29%，二者的流產(chǎn)率差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009 3)。

2.2外周血淋巴細(xì)胞百分比的差異比較 與110例健康女性相比，153例RM患者外周血CD3+(T淋巴細(xì)胞)、CD3+CD4+(Th細(xì)胞)、CD3+CD8+(TS細(xì)胞)、CD19+(B淋巴細(xì)胞)型淋巴細(xì)胞百分比沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CD16+CD56+型淋巴細(xì)胞(NK細(xì)胞)的百分比(14.26%±5.42%)顯著高于對(duì)照組(9.56%±4.68%)，P<0.001(圖1A)。外周血NK細(xì)胞百分比ROC曲線分析(AUC=0.737 8)顯示，NK細(xì)胞百分比> 17.5%對(duì)于RM患者具有高度特異性(94.55%)，敏感度21.57%(95%CI=15.34% to 28.94%),約登指數(shù)(Youden index)0.162，似然比(Likelihood ratio)3.954(圖1B)。

圖1 RM組與對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞百分比差異Fig.1 Differences in peripheral blood lymphocytes between RM group and control groupNote:A.Percentage difference in each subgroup of lymphocytes;B.Analysis of ROC curve of peripheral NK cells.***.P<0.001.

2.3外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比在不同亞組之間的差異比較 與RM非孕患者相比，有RM病史的早孕患者外周血T淋巴細(xì)胞，Th細(xì)胞百分比顯著增高(P<0.001),TS細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NK細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.001);健康對(duì)照女性中，早孕女性外周血T淋巴細(xì)胞、TS細(xì)胞百分比顯著增高(P<0.001),Th細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NK細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.001)。在所有婦女中，孕期NK細(xì)胞百分比相對(duì)非孕期均顯著降低(P<0.001)。RM非孕患者與對(duì)照非孕女性相比，Th細(xì)胞百分比較低，NK細(xì)胞百分比較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組及對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群改變及顯著性比較

Tab.1 Summary of lymphocyte subsets parameter alterations and significance in RMs compared with Controls

RMs(n=153)Non-pregnant(n=66)x±sMedian(Range) Pregnant(n=87)x±sMedian(Range) tPControls(n=110)Non-pregnant(n=42)x±sMedian(Range) Pregnant(n=68)x±sMedian(Range) tPT70.41±8.3673(56,84)74.16±6.6776(57,83)3.9190.000 71.33±5.0272(64,79)75.79±6.5876.5(59,87)4.0580.000 TH35.73±4.4635(32,45)39.06±6.3240(27,51)3.480.000 38.67±8.6839(20,49)38.21±5.1139(27,55)0.4200.674TS28.89±6.1427(19,43)30.10±7.2931(17,48)1.2640.20629.18±6.2725(22,41)32.43±6.6332(20,46)2.9700.003NK15.81±4.9916(6,32)12.67±4.4813(3,32)3.2810.00111.90±4.3210(7,21)8.96±4.788(1,25)2.6870.007B11.29±3.9310(6,19)11.53±4.1511(6,22)0.2510.80211.62±1.8211(10,15)12.71±3.9112(5,24)0.9960.320

2.4外周血淋巴細(xì)胞亞群對(duì)妊娠結(jié)局的影響 RM組流產(chǎn)者與繼續(xù)妊娠者相比，外周血T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NK細(xì)胞百分比高于繼續(xù)妊娠者，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)于對(duì)照組女性，流產(chǎn)者與繼續(xù)妊娠者淋巴細(xì)胞亞群百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。NK細(xì)胞百分比與 RM早孕患者妊娠結(jié)局的ROC曲線分析(AUC=0.741 6)顯示(圖2B)，NK細(xì)胞百分比> 13.5%對(duì)于RM早期流產(chǎn)女性具有高度特異度(86.49%)，敏感度56%(95%CI=41.25% to 70.01%),約登指數(shù)(Youden index)0.424 9，似然比(Likelihood ratio)4.144。

圖2 外周血淋巴細(xì)胞亞群對(duì)妊娠結(jié)局的影響Fig.2 Influence of peripheral blood lymphocyte subsets for pregnancy outcomesNote:A.Percentage difference in lymphocyte subsets with different pregnancy outcomes;B.ROC analysis of NK cell percentage for pregnancy outcome in early pregnant patients with RM.**.P<0.01.

3 討論

近年來，免疫型RM的發(fā)病率增加[6]。根據(jù)免疫類型，RM分為自身免疫型RM和同種免疫型RM。同種免疫型RM分為由NK細(xì)胞數(shù)量及活性升高、巨噬細(xì)胞功能異常、樹突狀細(xì)胞功能異常、補(bǔ)體系統(tǒng)異常等引起的固有免疫紊亂及由T/B淋巴細(xì)胞異常、Th1/Th2細(xì)胞因子異常引起的獲得性免疫紊亂[7]。 越來越多的研究表明母胎界面的淋巴細(xì)胞構(gòu)成的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在維持正常妊娠中起重要作用[8-12]。

T淋巴細(xì)胞是人體主要的CD3+型免疫細(xì)胞，根據(jù)T淋巴細(xì)胞表型的不同，可分為CD3+CD4+輔助型T細(xì)胞和CD3+CD8+抑制型(細(xì)胞毒性)T細(xì)胞。輔助型T細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子，參與體內(nèi)免疫調(diào)控和免疫耐受調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)母胎界面免疫耐受，影響胚胎著床、滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕及胚胎正常發(fā)育[4,5,13-15]。既往研究表明，未孕RM患者和具有正常生育能力的未孕婦女外周血 T淋巴細(xì)胞、Th細(xì)胞百分比水平無差異，而TS細(xì)胞百分比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。在本項(xiàng)研究中，RM患者與健康對(duì)照女性相比，T淋巴細(xì)胞亞群無明顯差異；在所有婦女中，早孕女性的T淋巴細(xì)胞百分比均高于未孕女性。有趣的是RM早孕患者以Th細(xì)胞百分比增高為主，而正常對(duì)照早孕女性以TS細(xì)胞增高為主，結(jié)果提示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者妊娠可能與正常妊娠免疫調(diào)節(jié)的方向有所不同，主要是以輔助型T細(xì)胞百分比增加為主，通過增加其分泌的細(xì)胞因子，加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)，促使及維持妊娠。

NK細(xì)胞是一種大顆粒淋巴細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞和感染細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，同時(shí)可以產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[17,18]。既往研究表明，外周血NK細(xì)胞異常與原因不明的RM有因果關(guān)系，并可能參與 RM的病理生理學(xué)。NK細(xì)胞異常一方面可導(dǎo)致母體固有免疫紊亂，另一方面可攻擊絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞，阻礙絨毛侵蝕及母胎循環(huán)建立，從而導(dǎo)致流產(chǎn)，而這一現(xiàn)象在正常流產(chǎn)中并不顯著。Ebina等[19]的研究提示外周血NK細(xì)胞的活性增加與不明原因的RM相關(guān)。且RM子宮NK細(xì)胞功能及活性異常，與外周血NK細(xì)胞數(shù)目增加有關(guān)[20]，通過下調(diào)外周血NK細(xì)胞的百分比能夠改善復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠結(jié)局[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者NK細(xì)胞百分比明顯高于正常對(duì)照女性。外周血NK細(xì)胞百分比17.5%是一個(gè)可以嘗試診斷自身免疫型RM患者NK細(xì)胞異常的標(biāo)準(zhǔn)。在King等[21]的研究中比較RM組和對(duì)照組之間的NK細(xì)胞百分比的ROC分析(AUC=0.706)顯示，NK細(xì)胞百分比> 18%對(duì)于RM(97.0%)女性具有高度特異性，Hajar Adib Rad等[22]的研究提示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)非孕女性外周血NK細(xì)胞百分比相對(duì)于正常對(duì)照女性增加，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者評(píng)估中具有預(yù)測價(jià)值，本研究結(jié)果與之相符。RM患者中，流產(chǎn)患者的NK細(xì)胞百分比明顯高于繼續(xù)妊娠患者，表明NK細(xì)胞百分比增高對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者再次妊娠結(jié)局有不良影響。ROC曲線分析提示RM患者早孕期NK細(xì)胞百分比小于13.5%有良好的妊娠結(jié)局。這可能是RM早孕患者是否進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療的新轉(zhuǎn)折點(diǎn)。 總之，外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比的異常直接反映了RM妊娠建立中存在著免疫功能紊亂。NK細(xì)胞百分比可作為預(yù)測RM患者再次妊娠結(jié)局的一個(gè)潛在指標(biāo)，為RM患者孕期是否進(jìn)行免疫治療提供理論依據(jù)。然而，NK細(xì)胞百分比增高導(dǎo)致流產(chǎn)的病理機(jī)制及高NK水平的RM患者的NK水平應(yīng)控制到多少才會(huì)從免疫治療中獲益有待進(jìn)一步的研究。