徐明軍 辛 毅 劉麗坤 吳大暢

(大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，大連 116044)

機體是一個巨大的微生態(tài)系統(tǒng)，其中腸道菌群發(fā)揮著生物拮抗、免疫調(diào)節(jié)、維持微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等重要作用[1]?？股氐倪^量、不合理應用容易造成腸道菌群紊亂及細菌易位，進而引發(fā)機體內(nèi)源性感染、免疫力低下[2]。目前，基于恢復腸道微生態(tài)菌群平衡、用于該類疾病治療的微生態(tài)制劑主要有：益生菌(Probiotics)、益生元(Prebiotics)和合生元(Synbiotics)。

來源于海洋藻類、真菌(蘑菇)以及某些陸生植物的多糖物質(zhì)，對人體腸道菌群具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而，國內(nèi)對于該類功能性食品的開發(fā)應用卻遠遠落后于對腸道益生菌的研發(fā)。來源于食品的益生元能夠維持腸道微生態(tài)的穩(wěn)態(tài)，促進益生菌的定植，從而提高機體免疫力，促進人體健康[3]。經(jīng)過大量的文獻檢索，我們發(fā)現(xiàn)國內(nèi)對于功能性食品的基礎研究亦很有限，雖然生產(chǎn)企業(yè)對于功能性食品的開發(fā)相對較多，但更多的是針對單一組分的開發(fā)，對于多組分配方產(chǎn)品的研究相對較少。基于此，本研究通過大劑量抗生素沖擊法建立小鼠腸道菌群失衡模型；將滸苔、香菇等按一定比例混合制備以海藻為主要成分的功能食品，觀察海藻類功能食品對腸道菌群失調(diào)實驗小鼠菌群重建及非特異性免疫的影響，為開發(fā)以滸苔等海洋藻類為主要原料的健康食品提供實驗依據(jù)和基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康4周齡，雄性，體重18～20 g 的SPF 級昆明種小鼠，購于大連醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2儀器和試劑 UVS-1渦旋振蕩器(北京優(yōu)晟科技有限公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(離心半徑6 cm)(安徽中科中佳科學有限公司)；JY-spat瓊脂糖電泳儀、Dcode變性梯度凝膠系統(tǒng)(大連競邁生物科技有限公司)；甲硝唑片(北京秦武田制藥有限公司，批號：H11022489)；阿莫西林膠囊(哈藥集團制藥總廠，批號：H23020932)；鹽酸左氧氟沙星片(哈藥集團三精制藥諾捷有限責任公司，批號：H20054408)；糞便細菌DNA提取試劑盒(成都福際生物技術有限公司)；PCR引物合成：GC-341F、341F、518R(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)；2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)；DL2000 Marker、DL100 Marker(大連寶生物工程有限公司)；小鼠白介素(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Elabscience)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙錠(大連羽銘生物科技有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1海藻糖類配方鼠糧的制備 按以下比例制備海藻糖類原料200 g：滸苔15%、鹿角菜15%、裙帶菜15%、香菇15%、滑菇10%、舞菇 10%、刺五加5%、青蒿5%、海參干粉5%、蛹蟲草5%。經(jīng)清洗烘干粉碎成粉末狀。將以上海藻糖類原料與正常成分鼠糧以1∶2的比例混合制成配方鼠糧：即取普通鼠糧400 g，浸泡6 h攪勻成糊狀，將兩者充分混合，烘干后成配方鼠糧。

1.2.2抗生素所致腸道菌群失衡小鼠模型的建立與分組 將28只小鼠隨機分為正常對照組7只，免疫低下組21只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)。免疫低下組小鼠用抗生素(甲硝唑片、阿莫西林膠囊、鹽酸左氧氟沙星片按4∶5∶1的劑量比用生理鹽水混合，每天灌胃2次，每只小鼠一次灌胃200 μl)灌胃2周。正常組小鼠灌胃同體積生理鹽水2周。造模成功的小鼠(體重較正常組降低，腸道菌群檢測與正常組比較有明顯改變)再隨機分為模型組7只，自然恢復組7只，配方食品治療組7只，自然恢復組正常喂食1周，治療組喂食海藻配方鼠糧1周。

1.2.3腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

1.2.3.1糞便細菌總DNA提取 留取各組小鼠新鮮糞便，收集于無菌EP管，-80℃保存?zhèn)溆?。嚴格按照試劑盒操作說明提取各組小鼠糞便細菌總DNA。

1.2.3.2PCR擴增 利用PCR過程擴增糞便菌群基因組的16S rRNA基因的V3可變區(qū)序列，參考通用引物序列如下：上游引物：GC-341F (5′-GC夾-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、下游引物：518R(5′-ATTACCGCGGCTGG-3′)，其中“GC夾”40 bp，序列為CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC-ACGGGGGG。擴增體系(50 μl)為：DNA模板3 μl，上下游引物10 pmol/μl各2 μl，ddH2O 18 μl，2×PCR SuperMix 25 μl。PCR擴增條件：首先，94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物置4℃保存，2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，以2 000 bp Marker為參照，出現(xiàn)清晰目標條帶說明擴增反應成功。

1.2.3.3變性梯度凝膠電泳(DGGE) 配制30%～60% DGGE變性梯度凝膠，PCR產(chǎn)物于DGGE膠60℃、80 V電泳5 h后，取出凝膠使用EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)檢測并采集圖像。利用Phoretix1D(Phoretix，NewcastleuponTyne，UK)軟件分析PCR-DGGE圖像。

1.2.3.4差異顯著條帶序列分析 以無菌手術刀片切下DGGE圖譜中差異顯著條帶于EP管中，加入20 μl無菌水并搗碎，于95℃浸泡10 min 后37℃過夜，取上清液作模板，以無GC夾的341F為上游引物，其余完全同前進行PCR擴增。產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳，切膠后進行回收純化，由Invitrogen(北京)公司測序。序列拼接后在GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行Blast比對分析。

1.2.4小鼠血清細胞因子水平測定 于每組小鼠處理結(jié)束后進行眼球采血，37℃水浴20 min后3 000 r/min離心10 min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。測定時以血清樣品稀釋液稀釋血清，小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-2表達水平測定采用ELISA方法，嚴格按照試劑盒操作說明進行測定。

2 結(jié)果

2.1抗生素所致腸道菌群失衡模型的建立 小鼠經(jīng)抗生素灌胃2周后，精神狀態(tài)萎靡，體重明顯下降，同時便型變得稀軟，PCR-DGGE結(jié)果提示菌群結(jié)構(gòu)較正常組發(fā)生明顯改變(圖1)，TNF-α、IL-2表達水平明顯下降(P<0.05，表1)。

表1 小鼠血清相關免疫細胞因子表達水平Tab.1 Expression levels of inflammatory factors in mice

圖1 糞便細菌PCR-DGGE電泳圖譜Fig.1 PCR-DGGE profiling of fecal microbiota Note:1-3.Normal control group；4-6.Natural recovering group；7-9.Treatment group；10-12.Model group .

2.2PCR-DGGE電泳結(jié)果 圖1為小鼠糞便細菌總DNA的PCR-DGGE電泳結(jié)果：同一泳道不同的條帶代表不同菌群，條帶灰度反映菌群相對數(shù)量的多少。正常對照組(1～3)條帶數(shù)較多，多樣性豐富；腸道菌群失衡模型組(10～12)條帶數(shù)目及單一條帶的灰度值均明顯下降，與正常組比較存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且在模型組出現(xiàn)均一的特征性條帶B。經(jīng)喂食海藻類功能性食品后，可見治療組(7～9)的條帶數(shù)目及灰度明顯增強，其圖譜類型更趨近于正常對照組，并出現(xiàn)特異性增強條帶C。自然恢復組(4～6)雖然條帶多樣性增強，有預后表現(xiàn)，但其效果仍不如海藻類功能食品的治療組，特別是特異性條帶A所代表的菌群恢復程度較差。使用Phoretix 1D軟件對小鼠腸道菌群DGGE 圖譜進行UPGMA相似性聚類分析，由結(jié)果可見：1～12條帶構(gòu)成了有統(tǒng)計學意義的四簇譜圖。小鼠按照是否造模及喂養(yǎng)方式的不同分別聚成一簇，其中1、2號屬于Ⅰ組，4～6號為Ⅱ組，7～9號是Ⅲ組，10～12號是Ⅳ組。

2.3條帶測序結(jié)果 對DGGE圖譜中差異顯著的條帶經(jīng)切離、克隆、測序、GenBank 數(shù)據(jù)庫比較分析后，結(jié)果如表2所示。A條帶代表乳酸菌屬細菌，其在正常對照組及治療組小鼠糞便中含量較高；B條帶為Barnesiellaintestinihominis(一種與多種疾病發(fā)生及腸黏膜免疫低下密切相關的紫單胞菌科細菌)，其含量在模型組顯著高于正常對照組和治療組；C條帶為普氏菌屬細菌(一種中性菌)，治療組小鼠糞便中普氏菌與正常組比較略有增高，而模型組和自然恢復組該類菌的含量較正常對照組明顯下調(diào)。以上結(jié)果均提示，抗生素處理后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常對照組相比發(fā)生顯著改變，應用功能食品治療后小鼠腸道菌群較模型組有明顯差異，其變化更接近于正常組，治療效果明顯。

2.4相關細胞因子水平 由表1可知抗生素能顯著降低小鼠血清細胞因子IL-2、TNF-α的水平，模型組小鼠的IL-2和TNF-α的表達量均顯著低于對照組(P<0.05)，而海藻類功能食品可以顯著提高小鼠血清IL-2和TNF-α水平，其產(chǎn)生量接近正常水平，與模型組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明，抗生素在導致小鼠菌群失衡的同時，降低其免疫能力，而海藻類功能食品能夠調(diào)節(jié)小鼠免疫低下狀態(tài)。

表2 DGGE差異顯著條帶對應的細菌V3區(qū)測序結(jié)果Tab.2 Identification by sequence of V3 fragments excised from DGGE significant difference bands of total microbial community

3 討論

多種天然產(chǎn)物具有益生元樣作用，且其來源廣泛、療效獨特、毒副作用小，具有“已病治病，未病防病，無病強身”的特點。海藻中含有較多的多糖纖維素、少量脂肪、豐富的無機鹽和維生素。多糖提取物被諸多研究證明對人體健康有益，多糖也被認為是一種免疫調(diào)節(jié)劑[4]，而不同來源的多糖提取物具有抗癌、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗炎等多種活性[5-8]。海藻來源廣泛，熱能低，尤其適合于老年人和體質(zhì)虛弱者食用[9]。

近年來，天然產(chǎn)物與腸道菌群的關系受到人們的廣泛關注，但有關天然產(chǎn)物對腸道菌群和免疫的影響相關研究不多。本實驗從腸道微生態(tài)的角度來研究海藻類功能食品的免疫調(diào)節(jié)作用，采用抗生素構(gòu)建腸道菌群失衡模型，研究海藻類功能食品對小鼠免疫細胞因子分泌水平的影響。結(jié)果表明：抗生素灌胃后導致小鼠腸道菌群失調(diào)，相關免疫細胞因子水平下降，模型組小鼠體內(nèi)Barnesiellaintestinihominis等抑制機體免疫力的菌群量明顯高于正常及治療組，治療組小鼠乳酸桿菌等有益菌及腸道菌群多樣性恢復較好且小鼠血清細胞因子濃度明顯升高，以上指標變化均優(yōu)于自然恢復組。綜上可知：海藻類功能食品對于提高小鼠免疫力有顯著效果。

當機體免疫功能改變時，也常常伴隨著腸道微生態(tài)的破壞，而腸道微生態(tài)破壞的主要表現(xiàn)即腸道菌群的失調(diào)[10-12]，同時血清中細胞因子濃度也會有相應的改變。Daillère等[13]的研究結(jié)果顯示，Barnesiellaintestinihominis屬巴氏桿菌屬，能改變腫瘤微環(huán)境，降低調(diào)節(jié)性T細胞濃度和刺激同源抗腫瘤CTL應答，具體作用機制可能與萬古霉素耐藥腸球菌的清除有關。乳酸桿菌(Lacticacidbacteria)可發(fā)酵碳水化合物(主要為葡萄糖)，產(chǎn)生大量乳酸，具有提高機體免疫力，調(diào)節(jié)機體特異性及非特異性免疫的作用，是廣泛應用的益生菌[14]。本實驗中模型組小鼠體內(nèi)Barnesiellaintestinihominis明顯高于治療組及正常對照組，經(jīng)海藻多糖喂食的小鼠腸道菌群與對照組小鼠相比腸道菌群多樣性及有益菌恢復較好。IL-2為T細胞生長因子，能夠活化Th1細胞，促進CTL的增殖，參與抗體反應；TNF-α能夠促進T和B淋巴細胞增生。本實驗中，功能食品可提高血清中IL-2和TNF-α的表達水平，進而增強了機體免疫功能。

綜上，在應用抗生素建立腸道菌群失衡模型后，導致益生菌數(shù)量大大下降，營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收不良，糞便蓄積，小鼠腸道免疫功能下降。海藻類功能食品中可能存在一定的免疫刺激因子，促進免疫細胞抵御吞噬作用并調(diào)節(jié)細胞因子的正常分泌，進而發(fā)揮增強免疫作用。海藻類功能食品作為一種新型免疫增強劑具有良好的開發(fā)應用前景，但其具體作用機制仍需要深入探討。