郭向輝 吳雅坤

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院急診科，唐山 063000)

重癥急性胰腺炎并發(fā)癥多、死亡率高，其發(fā)病機制和炎性細(xì)胞因子、胰酶活性、細(xì)胞凋亡因子失訪、微循環(huán)障礙等多種因素關(guān)系密切。當(dāng)胰腺內(nèi)消化酶被異?；罨瘯r可發(fā)生重癥急性胰腺炎，重癥急性胰腺炎發(fā)作時胰蛋白酶和溶酶體酶接觸而被激活，激活的胰蛋白酶導(dǎo)致胰蛋白酶原分子活化，消化酶的活化導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子分泌，引起胰腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、血管損傷、水腫、細(xì)胞死亡等[1]。重癥急性胰腺炎受損的胰腺組織釋放大量炎性介質(zhì)可引起肝損傷、肺損傷等并發(fā)癥的發(fā)生[2]。紫草素是一種從紫草中提取的萘醌類化合物，具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性，對重癥急性胰腺炎具有保護作用[3]，但其作用機制尚不清楚。TLR4/NF-κB在重癥急性胰腺炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，該通路激活可調(diào)控炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而參與炎癥反應(yīng)[4]。本文就紫草素對大鼠重癥急性胰腺炎的保護作用及其對TLR4/NF-κB信號通路的影響進(jìn)行研究，探討紫草素保護大鼠重癥急性胰腺炎的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：體質(zhì)量380～410 g、雌雄各半、Wistar大鼠100只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2015-0001。主要試劑：紫草素(成都德思特公司，批號：DST170210-036)，HE染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Sigma公司)，兔抗鼠IL-6單克隆抗體、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體、兔抗鼠NF-κBp65單克隆抗體、兔抗鼠IκB-α單克隆抗體等抗體(英國Abcam公司)等。

1.2方法

1.2.1動物分組 將100只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為對照組，模型組，紫草素1組和紫草素2組，每組25只。

1.2.2建立重癥急性胰腺炎模型及處理 將模型組、紫草素1組和紫草素2組大鼠禁食12 h，平臥固定到手術(shù)臺上，備皮、消毒、鋪巾，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取上腹部正中切口，暴露胰腺頭部，辨認(rèn)十二指腸乳頭，在十二指腸乳頭旁用留置針穿破腸壁，沿乳頭方向探入胰膽管并推入1.5 cm，微血管鑷加管固定，并同時用微血管鑷夾閉肝總管。以0.1 ml/min 的速度推注3.5%?；敲撗跄懰徕c0.1 ml/100 g，觀察大鼠胰腺情況，胰腺出現(xiàn)種植、皂化斑形成、點狀出血、壞死等改變?yōu)樵炷３晒?；對照組大鼠僅開腹，并翻動胰腺數(shù)次，關(guān)腹。紫草素1組和紫草素2組于術(shù)前1 d分別給予紫草素1 mg/kg和2 mg/kg腹腔注射，每日1次[5]；對照組和模型組注射等量生理鹽水。

1.2.3標(biāo)本采集 建模后24 h，各組取10只大鼠，抽取眼眶血用于測定血脂肪酶和淀粉酶水平；稱取大鼠體重，斷頸處死大鼠后取胰腺組織，稱取胰腺重量，計算胰腺重量指數(shù)=胰腺重量/大鼠體重×100%，取胰腺組織用于Western blot檢測。每組取10只大鼠，斷頸處死后取胰腺組織，于福爾馬林中固定、石蠟包埋，用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.4ELISA測定血清脂肪酶、淀粉酶水平 將各組大鼠眶靜脈血3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法測定血清脂肪酶和淀粉酶水平。

1.2.5伊紅-蘇木素(HE)染色測定胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化 將各組小鼠胰腺石蠟組織切成后5 μm 厚切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下拍照并觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化。按照改良Kusske評分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行胰腺病理評分：無炎細(xì)胞浸潤、出血、水腫、壞死為0分；壞死面積1%～10%，出血、水腫0～25%為1分；壞死面積11%～20%，出血、水腫25%～50%為2分；壞死面積21%～30%，出血、水腫50%～75%為3分；壞死面積>30%，出血、水腫>75%為4分。5個炎細(xì)胞為0.5分，>30個炎細(xì)胞為4分。胰腺病理評分為壞死得分+出血得分+水腫得分+炎癥得分。

1.2.6Western blot測定胰腺組織中IL-6、TNF-α、NF-κBp65和IκB-α蛋白水平 將胰腺組織勻漿，提取胰腺組織總蛋白，采用BCA測定胰腺組織蛋白濃度及含量，每孔上樣20 μg，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗：兔抗鼠IL-6單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠NF-κBp65單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠IκB-α單克隆抗體(1∶1 000)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗孵育1 h，加入顯色液顯色，采用Quantity One軟件分析各蛋白條帶亮度，胰腺組織中IL-6、TNF-α、NF-κBp65和IκB-α蛋白水平以IL-6、TNF-α、NF-κBp65和IκB-α蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.7免疫組化法測定胰腺組織中NF-κBp65蛋白表達(dá) 將石蠟包埋胰腺組織切片脫蠟，與過氧化氫孵育10 min，放入檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)10 min，加入山羊血清封閉30 min，加入一抗：兔抗鼠IκB-α單克隆抗體(1∶200)過夜孵育，加入二抗孵育1 h，陰性對照用PBS代替，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明、中性樹膠封片。細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用Image-Pro-plus6.0圖像分析軟件計算NF-κBp65陽性細(xì)胞率(NF-κBp65陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平比較 與對照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平比較

2.2各組大鼠胰腺組織HE染色比較 對照組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)未見明顯異常，模型組大鼠胰腺組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死等損傷明顯，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死明顯減輕，且紫草素2組病理損傷較紫草素1組輕。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of pancreatic tissue in rats of each group(×400)

與對照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺病理損傷指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺病理損傷指數(shù)降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺病理損傷指數(shù)降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胰腺病理損傷指數(shù)比較

2.3各組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平比較 與對照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平降低(P<0.05)。見表3和圖2。

表3 各組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平比較

圖2 各組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot of IL-6 and TNF-α protein in pancreatic tissue of rats of each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Shikonin 1 group;4.Shikonin 2 group.

2.4各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65和IκB-α蛋白水平比較 與對照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平升高(P<0.05)，IκB-α蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平降低(P<0.05)，IκB-α蛋白水平升高(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平降低(P<0.05)，IκB-α蛋白水平升高(P<0.05)。見表4和圖3。

表4 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65和IκB-α蛋白水平比較

圖3 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65和IκB-α蛋白Western blot電泳圖Fig.3 Western blot of NF-κBp65 and IκB-α protein in pancreatic tissue of rats of each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Shikonin 1 group;4.Shikonin 2 group.

2.5各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)情況比較 與對照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽性細(xì)胞率升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽性細(xì)胞率降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽性細(xì)胞率降低(P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白免疫組化染色(×400)Fig.4 Immunohistochemical staining of NF-κBp65 protein in pancreatic tissue of rats in each group(×400)

表5 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽性細(xì)胞率比較

3 討論

重癥急性胰腺炎主要表現(xiàn)為胰腺的出血和壞死，因常繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙等，故重癥急性胰腺炎的死亡率比較高[7]。目前治療重癥急性胰腺炎的藥物要么效果不理想，要么并發(fā)癥比較多，因此尋找治療重癥急性胰腺炎的新的藥物具有重要意義。 紫草為紫草科植物，藥用價值比較高，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝等多種生物活性，在多種疾病的治療中具有顯著療效[8]。紫草素是紫草的一種有效提取物，具有顯著的抑制炎癥反應(yīng)的作用，在關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷、局部腦缺血等疾病中抗炎效果顯著[9,10]。紫草素對重癥急性胰腺炎的胰腺組織、肺組織、腎組織均有保護作用[5,11,12]。本文對重癥急性胰腺炎大鼠給予紫草素治療，發(fā)現(xiàn)紫草素可降低重癥急性胰腺炎大鼠的胰腺重量指數(shù)、血脂肪酶和淀粉酶水平、胰腺病理損傷指數(shù)，高劑量紫草素對胰腺的保護作用較低劑量紫草素顯著。表明紫草素對重癥急性胰腺炎具有保護作用，分析紫草素具有顯著的抑制炎癥反應(yīng)的作用，其可能通過顯著的抑制炎癥反應(yīng)對重癥急性胰腺炎發(fā)揮保護作用。

炎癥反應(yīng)在重癥急性胰腺炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，IL-6和TNF-α是重癥急性胰腺炎研究中關(guān)注最多的炎癥細(xì)胞因子。IL-6在機體抗免疫反應(yīng)中具有重要作用，有巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生[13,14]；TNF-α為炎癥始動因子，介導(dǎo)IL-6等多種炎癥細(xì)胞因子的釋放，并可激活一氧化氮和氧自由基的生成，促進(jìn)白細(xì)胞趨化和黏附[15]，從而損傷胰腺組織。TLR4/NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16，17]，TLR4在胰腺細(xì)胞表面廣泛分布，當(dāng)胰腺受到損傷、感染、缺血等刺激時被激活，激活的TLR4可激活NF-κB，并激活MYD88，然后降解NF-κB上游的IκB，使p65進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)重癥急性胰腺炎的發(fā)生和TLR4/NF-κB信號通路的激活關(guān)系密切，抑制TLR4/NF-κB信號通路對重癥急性胰腺炎具有保護作用[19]。紫草素抗炎作用的機制和TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)，可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮作用，如紫草素通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路保護大鼠脊髓損傷[20]；紫草素通過抑制TLR4信號通路預(yù)防D-半乳糖胺和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷[21]；紫草素通過抑制TLR4/NF-κB信號通路保護實驗性缺血性腦卒中[22]。因此推測紫草素可能通過TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮保護重癥急性胰腺炎的作用，本文對此進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)：紫草素降低重癥急性胰腺炎大鼠胰腺重量指數(shù)、血脂肪酶和淀粉酶水平、胰腺病理損傷指數(shù)、胰腺組織中IL-6、TNF-α、NF-κBp65蛋白水平、NF-κBp65陽性細(xì)胞率，升高胰腺組織中IκB-α蛋白水平。分析重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中TLR4/NF-κB信號通路激活、炎癥細(xì)胞因子水平升高，胰腺組織受損；紫草素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路、降低其胰腺組織中炎性細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織的保護作用，且高劑量紫草素對重癥急性胰腺炎的保護作用較低劑量組顯著(對于紫草素對重癥急性胰腺炎的保護作用是否呈劑量依賴性及何種劑量為最佳劑量？本文由于篇幅有限未對其進(jìn)行詳細(xì)研究和探討，我們將在接下來的研究中對其進(jìn)行專項研究和探討)。

綜上所述，在重癥急性胰腺炎中，紫草素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對重癥急性胰腺炎的保護作用。