范英子 王 丹 周 琴 楊向貴 白婷婷 許 穎

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，成都 610500)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一組病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，反復(fù)發(fā)作累及胃腸道的非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病。其中潰瘍性結(jié)腸炎是結(jié)腸黏膜層和黏膜下層連續(xù)性炎癥，常累及部位為末端回腸、結(jié)腸和肛周。受遺傳、環(huán)境和微生物因素相互影響，關(guān)鍵因素為免疫功能紊亂[1，2]。結(jié)腸息肉(Colonic polyps)也為常見結(jié)腸病變之一,根據(jù)病理組織學(xué)可分為炎性息肉、腺瘤性息肉和增生性息肉，其中腺瘤性息肉與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，目前常用的檢測手段和治療方法為電子腸鏡[3，4]，腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致常見結(jié)腸息肉的發(fā)生。輔助性 T 細(xì)胞(helper T cells,Th細(xì)胞)及相關(guān)因子的調(diào)節(jié)參與黏膜炎癥的多種免疫應(yīng)答，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為結(jié)腸相關(guān)病變主要是由Th1細(xì)胞分泌的干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)介導(dǎo)，與Th2細(xì)胞分泌的IL-4等細(xì)胞因子無關(guān)。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞極化可能是炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制之一[5，6]。Th17細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)在人源細(xì)胞或組織中與IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子有關(guān),Th17細(xì)胞分泌的IL-17可以清除特定的細(xì)胞外病原體,起到抗感染保護(hù)作用,與自身抗原的特異性結(jié)合又可導(dǎo)致炎癥性自身免疫疾病[7，8]。本研究篩選成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院診斷為結(jié)腸息肉和潰瘍性結(jié)腸炎患者的病歷資料，收集實驗室檢查結(jié)果，在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平上檢測外周血中輔助T細(xì)胞內(nèi)外的相關(guān)細(xì)胞因子檢測,并進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)分析，為臨床診療工作提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：人IFN-γ 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，人IL-4 ELISA試劑盒，人IL-17 ELISA試劑盒(購自北京達(dá)科為)；RNA的提取試劑盒：RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR；qPCR預(yù)混液：ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixDNA聚合酶預(yù)混液(均購自南京諾唯贊生物科技有限公司)；流式抗體：均購自BioLegend公司，F(xiàn)ITC anti-human CD4/PE anti-human IL-4/PE anti-human IL-17/PE anti-human IFNγ；佛波酯(PMA)購自Sigma公司，IFN-γ-F：GAGAACCCAAAACGATGCA，IFN-γ-R：ACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCG，IL-17-F：CAACCGATCCACCTCACCTT，IL-17-R：GGCACTTTGCCTCCCAGAT，IL-4-F：AACAGCCTCACAGAGCAGAAG-AC，IL-4-R：GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT，ROR-F：GAGGAAGTGACTGGCTACCAGA，ROR-R：GCACAA-TCTGGTCATTCTGGCAG，T-bet-F：CCGTGACTGCC-TACCAGAAT，T-bet-R：TCATGCTGACTGCGCGAAA-C，GATA-3-F：AGGCAGGGAGTGTGTGAACT，GATA-3-R：TTTTTCGGTTTCTGGTATGG，以上引物均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2主要儀器 高速低溫離心機(jī)：SORVALL RC 6+Centrifuge購自ThermoFisher scientific；酶標(biāo)儀：Multiskan Mk3購自Thermo SCIENTIFIC；流式細(xì)胞儀購自BD FACSCalibur，PCR儀購自美國HACH公司。

1.2方法

1.2.1研究對象 將2017年08月到2018年08月期間在成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的111例結(jié)腸病變患者納入研究，其中男性72例，女性39例，平均年齡(44.32±9.26)歲，其中結(jié)腸息肉患者60例，潰瘍性結(jié)腸炎患者51例，所有患者均經(jīng)電子腸鏡檢查，近1個月內(nèi)均無妊娠，無家族性遺傳病史。選擇同期45名健康體檢者作為正常對照組，其中男性26例，女性19例，平均年齡(43.18±7.73)歲，結(jié)腸息肉組、潰瘍性結(jié)腸炎組及正常對照組在年齡、性別構(gòu)成上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2ELISA檢測外周血相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平 采集健康人群及患者清晨空腹外周血3～5 ml，非抗凝采血管，ELISA方法檢測外周血血清各細(xì)胞因子的含量，并進(jìn)行分析。使用前，充分混合所有試劑，避免產(chǎn)生泡沫。加樣：100 μl/well 加入稀釋后的 Cytokine standard 至標(biāo)準(zhǔn)品孔，100 μl/well 加入樣品至樣品孔，100 μl/well加 Dilution buffer R (×1)入空白對照孔。蓋上封板膜，室溫(18～25℃)孵育2 h。洗板：扣去孔內(nèi)液體，300 μl/well 加入 1×washing buffer；停留1 min后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)3次。加檢測抗體：100 μl/well 加入稀釋后的 Biotinylated antibody。蓋封板膜，室溫孵育1 h。加酶：100 μl/well 加入 Streptavidin-HRP。蓋上封板膜，室溫孵育30 min。顯色：100 μl/well 加入TMB，室溫避光溫育5～30 min，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺(深藍(lán)色)來判定終止反應(yīng)。終止反應(yīng)：100 μl/well加入 Stop solution 終止反應(yīng)。讀板：終止后用檢測波450 nm和校正波長630 nm。將零孔設(shè)為對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計算濃度。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th1/Th17/Th2細(xì)胞亞群 全血中加入適量的PMA后混勻，于5%CO2孵箱中37℃放置2～4 h。每管加入紅細(xì)胞裂解液避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，洗滌細(xì)胞后重復(fù)離心。加入適量FITC-CD4抗體,室溫下避光孵育20 min，洗滌離心后加入固定劑，室溫避光孵育20 min離心，棄上清，加入打孔劑，再洗滌。分別加入PE-IL-4/PE-IL-17/PE-IFNγ，避光孵育20 min，洗滌重懸，上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.2.4RT-PCR檢測外周血Th細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá) 人外周血總RNA的提取：全血中加入紅細(xì)胞裂解液后冰上孵育15 min，在孵育中渦旋振蕩混勻2次。 4℃ 2 100 r/min離心10 min后去上清。 向白細(xì)胞沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，再離心去除上清。向白細(xì)胞沉淀中加入裂解液RL，重懸后將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS中，12 000 r/min離心2 min，棄去過濾柱CS，收集濾液。向濾液中加入1倍體積70%乙醇混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR2中，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉廢液，將吸附柱CR2放回收集管。向吸附柱CR2中加入去蛋白液RW1，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。再向吸附柱CR2中央加入DNase Ⅰ 和去蛋白液RW1，離心后倒掉廢液，再向吸附柱CR2中加入漂洗液RW，室溫靜置2 min后離心，重復(fù)漂洗1次。將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入新的RNase-Free離心管中，加入RNase-Free ddH2O室溫放置2 min，離心后得到RNA。

RNA逆轉(zhuǎn)錄和qPCR：RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：模板RNA：1 pg～1 μg；5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix：4 μl；加RNase free ddH2O至總體積為20 μl。反應(yīng)條件：50℃ 15 min,85℃ 5 s。 qPCR反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl；Primer1 (10 μmol/L) 0.4 μl，Primer2 (10 μmol/L) 0.4 μl，Template DNA/cDNA(模板體積不超過反應(yīng)總體積的1/10)，加ddH2O至總體積為20 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)：95℃ 10 s，60℃ 30 s；融解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

2 結(jié)果

2.1正常人群和結(jié)腸病變患者外周血中Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平 和健康人群相比，結(jié)腸息肉組血清中的IL-4表達(dá)量低于正常對照組(P=0.031)，而潰瘍性結(jié)腸炎的表達(dá)量高于正常對照組(P=0.038)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩結(jié)腸病變組別之間無差異(P=0.256)。健康人群IL-17的表達(dá)量為(6.017±1.527)pg/ml，和兩結(jié)腸病變組相比，差異均無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，其中潰瘍性結(jié)腸炎組的表達(dá)量為(6.741±1.766)pg/ml(P=0.293)，潰瘍性結(jié)腸炎組的表達(dá)量為(5.426±1.633)pg/ml(P=0.484)。IFN-γ的結(jié)果提示，相比較健康人群，結(jié)腸息肉組和結(jié)腸炎組的表達(dá)均顯著升高，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。其中結(jié)腸息肉組表達(dá)量為(4.045±1.874)pg/ml(P=0.049)，結(jié)腸息肉組的表達(dá)量為(5.815±2.955)pg/ml(P=0.015)(圖1、表1)。

圖1 各組血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平Fig.1 Level of cytokines in serum of each groupNote:*.P<0.05;NS.No significant.

表1 各組外周血Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平pg/ml)

流式細(xì)胞術(shù)分析外周血Th細(xì)胞亞群分布，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉組CD4+/IL-4+T細(xì)胞百分比與正常組相近，而潰瘍性結(jié)腸炎患者的比例顯著升高，[P=0.003，(10.198±2.325)% vs (1.126±0.285)%]，具有統(tǒng)計學(xué)意義。和健康人群相比，潰瘍性結(jié)腸炎組CD4+/IL-17+T細(xì)胞百分比升高趨勢明顯[P=0.009，(9.152±1.932)% vs (1.785±1.066)%]，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。外周血CD4+/IFN-γ+的T細(xì)胞比例在正常組和結(jié)腸病變組中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，表2)。

圖2 各組血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平Fig.2 Level of cytokines in serum of each group

表2 各組外周血中Th1/Th17/Th2細(xì)胞亞群的百分比

2.2性別對結(jié)腸病變患者的Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響 結(jié)果提示：結(jié)腸息肉女性患者的血清中IL-4、IL-17水平略高于男性患者，差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；女性患者血清中IFN-γ的表達(dá)量相較于男性患者有所降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。潰瘍性結(jié)腸炎女性患者和男性患者血清中IL-4、IFN-γ表達(dá)水平相似；而女性患者的血清中IL-17的表達(dá)水平低于男性患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)(圖3)。

圖3 不同性別的結(jié)腸病變患者血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平Fig.3 Level of cytokines in serum of colonic disease patients in different sexNote:*.P<0.05;NS.No significant.

如表3所示：正常人群外周血Th1/Th17/Th2細(xì)胞比例無顯著的性別差異；在結(jié)腸息肉患者中，男性患者外周血CD4+/IL-4+T細(xì)胞百分比高于女性患者，而CD4+/IL-17+T細(xì)胞百分比在女性患者中有所升高，兩者差異均無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，CD4+/IFN-γ+T細(xì)胞的百分比在男性和女性患者中相似；潰瘍性結(jié)腸炎女性患者外周血CD4+/IL-17+T細(xì)胞百分比顯著高于男性患者[P=0.022，(12.356±3.862)% vs (8.503±2.748)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，性別對CD4+/IL-4+T細(xì)胞和CD4+/IFN-γ+T細(xì)胞百分比無顯著影響。

表3 各組外周血Th1/Th17/Th2細(xì)胞的不同性別中的分布Tab.3 Distribution of Th1/Th17/Th2 cells in different sex in peripheral blood of each group

2.3外周血中Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況 通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸息肉組IL-4的mRNA相對表達(dá)量低于正常對照組(P=0.028)，潰瘍性結(jié)腸炎組別高于正常對照組(P=0.009)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)腸息肉組IL-17 mRNA水平為(0.376±0.047)，相較于正常人群降低(P=0.025)；而潰瘍性結(jié)腸炎IL-17 mRNA水平為(46.171±10.328)，相較于正常人群顯著升高(P=0.004)。和正常人群相比，外周血IFN-γ的mRNA水平在結(jié)腸息肉組中為(1.184±1.191)(P=0.049)，潰瘍性結(jié)腸炎組中為(5.815±2.955)(P=0.008)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4，表4)。

圖4 各組外周血中IL-4/IL-17/IFN-γ和GATA-3/RORγt/T-bet轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of IL-4,IL-17,IFN-γ in peripheral blood of each group and GATA-3/RORγt/T-betNote:*.P<0.05;**.P<0.01.

表4 各組外周血中Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量

檢測與輔助性T細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉患者GATA-3/RORγt的mRNA相對表達(dá)量均與正常人群相似；T-bet的mRNA水平在結(jié)腸息肉和潰瘍性結(jié)腸炎中分別為0.687±0.882和1.835±0.987，均與正常對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義；潰瘍性結(jié)腸炎中，GATA-3/RORγt的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高，其中GATA-3的mRNA水平為26.530±3.270，RORγt的mRNA水平為38.257±7.680，相較于正常人群差異均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(GATA-3:P=0.001 2，RORγt：P=0.002 6)，(圖4，表5)。

表5 各組外周血中Th細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對表達(dá)量

2.4Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子和中心粒細(xì)胞/單核細(xì)胞比值的相關(guān)性分析 正常人群和結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞的比值分別為2.002±0.479，3.267±1.115，3.228±0.883，結(jié)腸病變患者中性粒/淋巴細(xì)胞比值均顯著高于正常人群，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012，P=0.003，圖5)。分別對兩種結(jié)腸病變組外周血IL-4、IL-17、IFN-γ的mRNA水平和外周血中性粒/淋巴細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，其中：IFN-γ的mRNA水平在結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎組中與外周血中性/淋巴比值均呈正相關(guān)(r=0.580；r=0.735，圖6)；結(jié)腸息肉患者IL-17水平與外周血中性/淋巴細(xì)胞比值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(r=0.718)，潰瘍性結(jié)腸炎患者中為正相關(guān)(r=0.744)；兩種結(jié)腸病變患者IL-4水平和外周血中性/淋巴細(xì)胞比值差異無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(結(jié)腸息肉組：r=0.085；潰瘍性結(jié)腸炎組：r=0.302)。

圖5 各組外周血中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比值Fig.5 Ratio of neutrophils and lymphocytes in peripheral blood of each groupNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

圖6 外周血中性粒/淋巴細(xì)胞的比值和IL-4、IL-17、IFN-γ的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of neutrophils/lymphocytes ratio and IL-4,IL-17,IFN-γ in peripheral blood

3 討論

我院結(jié)腸息肉患者常見于中老年人群，且出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作病情多變的特點，由于目前我國中老年人結(jié)腸鏡檢查普及率較低，尋找簡便快捷的檢驗手段可有效輔助監(jiān)測結(jié)腸病變患者的治療效果及病情變化。潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)為黏液血便，腹痛，是難治性腸道疾病之一，給患者及家屬帶來一定的精神壓力，輔助性T細(xì)胞亞群在UC的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[9]?；诖耍狙芯酷槍h細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子在兩種常見結(jié)腸病變外周血的表達(dá)情況進(jìn)行探討。Th1細(xì)胞是最早被發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群，抗原呈遞細(xì)胞分泌干擾素后作用于原始T細(xì)胞的STAT-1，再激活特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet，促使原始T細(xì)胞向Th1分化。Th1細(xì)胞分泌的促炎因子主要為IL-6、IFN-γ，研究表明Thl細(xì)胞在介導(dǎo)炎癥腸病中起關(guān)鍵作用。促炎反應(yīng)常局限在腸黏膜局部，遷移至血液循環(huán)中導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的研究甚少；IFN-γ主要由T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，能夠抗病毒和抗寄生蟲感染，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖和凋亡，雙向調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)[10]。本研究探究結(jié)腸息肉和潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中Th1細(xì)胞內(nèi)外IFN-γ的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)：潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中IFN-γ水平高于結(jié)腸息肉患者，其蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)較為一致，而胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)量和T-bet轉(zhuǎn)錄水平在潰瘍性結(jié)腸炎中有所下降，提示在潰瘍性結(jié)腸炎中胞外升高的IFN-γ可反饋調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的分化,需進(jìn)一步探究調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)腸息肉的血清IFN-γ水平升高程度低于潰瘍性結(jié)腸炎，可能與結(jié)腸組織的病理類型和病程進(jìn)展的分期有關(guān)，如腺瘤樣結(jié)腸息肉患者外周血IFN-γ水平反復(fù)升高，提示疾病有復(fù)發(fā)可能[11]。

Th2細(xì)胞也是較早發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群之一，當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞分泌IL-4作用于原始Th細(xì)胞表面受體后，被激活的STAT6活化特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3，使原始Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。Th2主要分泌IL-4、IL-13等細(xì)胞因子。IL-4主要由活化的T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞分泌，是一種多向性的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，并且在體內(nèi)外有一定的抗腫瘤活性[12]。有研究證實IL-4能夠抑制Th1細(xì)胞的活化，另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Th1型炎癥小鼠模型中用IL-4干預(yù)后出現(xiàn)炎癥加重的現(xiàn)象，提示IL-4可雙向調(diào)節(jié)Th1反應(yīng)。本研究中結(jié)腸病變患者血清中IL-4水平在不同類型的腸病中具有各自的特點：在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，雖然血清中IL-4含量較低，但是Th細(xì)胞胞內(nèi)分泌的IL-4顯著升高，同時轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達(dá)量顯著上調(diào)，提示在外周血微環(huán)境中，免疫調(diào)節(jié)主要集中在Th2細(xì)胞的分化，其中不排除IL-4對Th1細(xì)胞的競爭抑制作用；結(jié)腸息肉患者的Th2型免疫應(yīng)答在細(xì)胞內(nèi)外均受到微弱的抑制。

Th17細(xì)胞有助于闡述Th1/Th2細(xì)胞分化增殖的異?，F(xiàn)象和炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中的病理差異。IL-17是Th17細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的主要效應(yīng)因子，能夠聯(lián)合獲得性與先天性免疫系統(tǒng)來促進(jìn)炎癥發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)：IL-17在體內(nèi)外具有多種生物學(xué)活性,通過誘導(dǎo)促炎因子(如IL-6)、化學(xué)因子(如MCP-1、MIP-2)以及基質(zhì)金屬蛋白酶等促進(jìn)組織炎癥發(fā)生[13]。另有研究表明IBD患者的腸黏膜組織中IL-17的表達(dá)明顯高于正常對照，并且病理組織局部表達(dá)高于正常組織；IL-17可促使腸上皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-8中和IL-17的表達(dá)，抑制炎癥的發(fā)生；也有研究發(fā)現(xiàn)抑制IL-17表達(dá)反而使炎癥加重，可為一種雙向調(diào)節(jié)機(jī)制[14]。

本研究中結(jié)腸病變組血清中IL-17的含量和健康人群相比無顯著差異，但是在轉(zhuǎn)錄水平上和IL-4的變化趨勢相似，在結(jié)腸息肉組中低于正常人群，而在潰瘍性結(jié)腸炎中顯著高于正常人群；可能為不同病理類型的炎癥環(huán)境有差異，抑或外周血微環(huán)境中參與其他Th細(xì)胞的激活和分化。是否存在Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)需要進(jìn)一步驗證。潰瘍性結(jié)腸炎患者中Th17細(xì)胞比例顯著升高，分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)量也保持較高的水平，這些高表達(dá)的Th17細(xì)胞在機(jī)體循環(huán)的趨化途徑值得進(jìn)一步探討。近年研究發(fā)現(xiàn)IL-17主要在結(jié)直腸癌組織和腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可上調(diào)腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子[15-18]，而潰瘍性結(jié)腸炎是結(jié)腸癌的危險因素之一，研究Th17細(xì)胞功能為基于腫瘤血管生成的腫瘤免疫治療提供治療。目前對于性別影響外周血IL-17的表達(dá)水平的研究甚少，曾有報道在無癥狀的女性淋病患者胸腺基質(zhì)中，淋巴細(xì)胞生成素與宮頸分泌物的IL-17表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，本研究中潰瘍性結(jié)腸炎女性患者外周血IL-17胞內(nèi)表達(dá)水平低于男性患者，性激素是否影響外周血的Th17細(xì)胞的分化有待進(jìn)一步探討。

外周血中單個中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子遠(yuǎn)少于單個核細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯超過單個核細(xì)胞，便具有重要的病理意義。中性粒細(xì)胞不僅受促炎因子影響，一定刺激下也可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括IL-8、TNF-α、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白、IL-1β、IL-10、集落刺激因子等。本研究中，兩種結(jié)腸病變患者外周血中IL-4的mRNA水平與中性/淋巴比例的相關(guān)性較弱，可能與IL-4多向性的免疫功能有關(guān)，后續(xù)研究中，分析腸系膜淋巴結(jié)的Th細(xì)胞更有助于綜合評估Th細(xì)胞的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。IL-17參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化作用，本研究中結(jié)腸病變組的IL-17在轉(zhuǎn)錄水平上和外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)量存在較強(qiáng)的相關(guān)性：結(jié)腸息肉中，中性粒細(xì)胞分泌的IL-8等在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了Th17細(xì)胞的增殖；潰瘍性結(jié)腸炎中，IL-17隨著中性粒細(xì)胞增多而表達(dá)增強(qiáng)，發(fā)揮促炎作用，體現(xiàn)了其雙向調(diào)節(jié)功能。輔助性T細(xì)胞在炎性結(jié)腸病變患者中的作用機(jī)制目前尚不明確，但可以初步判斷Th1/Th17/Th2細(xì)胞在外周血中相互調(diào)節(jié)、相互抑制，分泌的多種細(xì)胞因子是一個動態(tài)平衡過程，其中Th17細(xì)胞更易發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。炎癥性結(jié)腸病變病因復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與輔助性T細(xì)胞的分化方向和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡有一定聯(lián)系，深入探討Th細(xì)胞的免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)，揭示其免疫發(fā)病機(jī)制，可為預(yù)測疾病的進(jìn)程及合理用藥提供新思路。