關(guān)愛(ài)華 蔡 勇 孫 瑜 李萬(wàn)鋒

(吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，長(zhǎng)春 130012)

乳腺癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率中位居首位，是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟演進(jìn)的復(fù)雜過(guò)程，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因，因此，預(yù)防和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。

免疫檢測(cè)點(diǎn)分子是腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。CD276屬于免疫檢查點(diǎn)分子的B7超家族，其在大多數(shù)正常組織中低表達(dá)，但在各種癌組織，包括乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等則異常高表達(dá)[2,3]，且其高表達(dá)與乳腺癌、宮頸癌、腎癌等有較差的預(yù)后相關(guān)[4-6]。但CD276對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性所產(chǎn)生的影響及其確切機(jī)制尚不十分清楚。鑒于CD276的表達(dá)與腫瘤分級(jí)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)，推測(cè)CD276可能與腫瘤細(xì)胞侵襲能力相關(guān)。

本文在乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中過(guò)表達(dá)CD276，在乳腺癌細(xì)胞系T-47D中敲低CD276的表達(dá)，研究過(guò)表達(dá)或敲低CD276的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其初步的作用機(jī)制，從而為闡明CD276的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)，以期為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-10A和T-47D細(xì)胞系購(gòu)自上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)，并由本院中心實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。CD276真核表達(dá)載體pcDNA3-CD276和pRNAT-CD276shRNA(CD276shRNA sequence:5′-GTGCTGGAGAAAGATCAAA-3′)由東北師范大學(xué)藥物基因和蛋白篩選國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。Snail、Slug和E-cadherin抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，抗CD276抗體購(gòu)自RB公司,抗GAPDH抗體購(gòu)自上?？党缮镉邢薰?，HRP標(biāo)記的第二抗體購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。PVDF膜購(gòu)于羅氏公司。預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自全式金公司。BrdU試劑盒購(gòu)自Roche Diagnostics (Mannheim，Germany)。細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。MTT購(gòu)自Amresco公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。國(guó)產(chǎn)新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 μg/ml的鏈霉素和100 U/ml的青霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。T-47D 細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10 μg/ml 胰島素的 1640培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前一天將MCF-10A或T-47D 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔細(xì)胞板中，24 h后將質(zhì)粒按3 μg/孔加入到100 μl無(wú)血清的DMEM或1640培養(yǎng)基中，充分混勻。然后加入5 μl的轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置30 min后，將混合液加入到6孔板中。在含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，然后進(jìn)行換液。在不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在MCF-10A或T-47D 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體和pcDNA3-CD276重組載體，轉(zhuǎn)染 48 h后，將兩組細(xì)胞鋪于24孔板中，用10%新生牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)16～24 h，使其形成單層細(xì)胞，用10 μl移液槍槍頭在單層細(xì)胞上劃痕，用PBS緩沖液清洗3次，洗去漂浮細(xì)胞，換成10%新生牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在0 h、24 h時(shí)倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞生長(zhǎng)遷移情況。

1.2.4Transwell 實(shí)驗(yàn) 4℃過(guò)夜融化基質(zhì)膠，并用預(yù)冷的不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基按1∶3稀釋基質(zhì)膠，使其終濃度達(dá)到1 mg/ml。將Transwell 小室放置于24孔板上，并加入100 μl稀釋的基質(zhì)膠，37℃孵育 4 h 使膠完全凝固。用含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，上室加入 0.5×105個(gè)細(xì)胞/孔，并在Transwell的下室加 600 μl 正常的 DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2孵育箱培養(yǎng)，40 h后從24孔細(xì)胞板中取出Transwell小室，PBS洗滌后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS 洗 3 次。用棉簽除去Transwell小室上未能侵入的細(xì)胞。0.5%TritonX-100作用5 min，PBS洗3次；用蘇木精對(duì)細(xì)胞核染色10 min，水沖洗；弱氨水10 s浸泡，水沖洗；伊紅細(xì)胞質(zhì)染色3 min，洗凈。顯微鏡下隨機(jī)選取不同的視野計(jì)數(shù)。

1.2.5Western blot 將培養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化后收集到離心管內(nèi)，4 000 r/min離心5 min；用PBS洗滌細(xì)胞3次，4 000 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入適量細(xì)胞裂解液冰上裂解，每隔5 min劇烈渦旋20 s，使細(xì)胞充分裂解，渦旋60 min后12 000 r/min離心5 min，收集上清至另一新的離心管中，加入適量的蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮沸8 min，用10% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，在100 V恒壓條件下將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將PVDF膜用含有0.2%Tween20的TBS緩沖液(TBST)洗滌3次，用含有5%脫脂奶粉的TBST 37℃封閉30 min；TBST洗滌3次后將第一抗體用TBST緩沖液稀釋后，與PVDF膜一同裝入雜交袋中，4℃過(guò)夜；用TBST緩沖液洗滌3次；將HRP標(biāo)記的二抗用TBST緩沖液稀釋后，與PVDF膜一同裝入新的雜交袋中，室溫?fù)u床上放置30 min或者1 h；TBST緩沖液洗滌3次；最后進(jìn)行ECL發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1CD276在正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 為了了解CD276在正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們利用Western blot方法檢測(cè)了CD276在乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，CD276在乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中呈低表達(dá)，但在乳腺癌細(xì)胞T-47D中呈高表達(dá)。

圖1 CD276在正常乳腺細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)分析Fig.1 Expression of CD276 in normal breast cells and cancer cells

2.2在乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD276及在乳腺癌細(xì)胞中敲低CD276表達(dá)的鑒定 在MCF-10A細(xì)胞中分別瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達(dá)載體，在T-47D細(xì)胞中分別瞬轉(zhuǎn)pRNAT空載體和pRNAT-CD276shRNA載體，之后對(duì)CD276的過(guò)表達(dá)及敲低情況進(jìn)行了鑒定。結(jié)果如圖2所示，在MCF-10A細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.0-CD276真核表達(dá)載體后明顯增加了CD276的表達(dá)，而在T-47D細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)pRNAT-CD276shRNA載體可明顯抑制CD276的表達(dá)。

圖2 CD276過(guò)表達(dá)及敲低的效果鑒定Fig.2 Identification efficiency of CD276 overexpression and knocking down

2.3CD276對(duì)乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 在MCF-10A細(xì)胞中分別瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達(dá)載體，之后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3A所示，過(guò)表達(dá)CD276后明顯增強(qiáng)了MCF-10A細(xì)胞的遷移能力。在T-47D細(xì)胞中分別瞬轉(zhuǎn)pRNAT空載體和pRNAT-CD276shRNA載體，之后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3B所示，敲低CD276的表達(dá)明顯抑制了T-47D細(xì)胞的遷移能力。

圖3 劃痕法檢測(cè)CD276對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of CD276 on cell migration was detected by wound healing assayNote:A.Effect of CD276 overexpression on the migration of MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the migration of T-47D cells.

2.4CD276對(duì)乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 在MCF-10A中分別瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達(dá)載體，之后進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4A所示， 過(guò)表達(dá)CD276后明顯促進(jìn)了乳腺上皮細(xì)胞的侵襲能力。在T-47D細(xì)胞中分別瞬轉(zhuǎn)pRNAT空載體和pRNAT-CD276shRNA載體，之后進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4B所示，敲低CD276的表達(dá)明顯抑制了乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 Transwell法檢測(cè)CD276對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of CD276 on cell invasion was detected by Transwell assayNote:A.Effect of CD276 overexpression on the invation of MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the invation of T-47D cells.

2.5CD276對(duì)侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 在MCF-10A腫瘤細(xì)胞中，分別瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-CD276真核表達(dá)載體，于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞， 提取蛋白，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)周期相關(guān)蛋白。結(jié)果如圖5A所示，在MCF-10A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD276可抑制侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)Snail和Slug的表達(dá)。在T-47D腫瘤細(xì)胞中，分別瞬轉(zhuǎn)pRNAT空載體和pRNAT-CD276sh RNA真核表達(dá)載體，于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)周期相關(guān)蛋白。結(jié)果如圖5B所示，在T-47D細(xì)胞中敲低CD276的表達(dá)可促進(jìn)侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，抑制Snail和Slug的表達(dá)。

圖5 Western blot方法檢測(cè)CD276對(duì)細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of CD276 on expression of cell invasion related proteins were detected by Western blot analysisNote:A.Effect of CD276 overexpression on the expression of invation related proteins in MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the expression of invation related proteins in T-47D cells.

3 討論

乳腺癌是威脅全球女性健康最主要的疾病之一，目前盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)了更有效的細(xì)胞毒性藥物、激素和抗Her2治療乳腺癌的方法，但轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍無(wú)法治愈[7]，因此仍需要進(jìn)一步解析乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以便為乳腺癌提供新的治療靶點(diǎn)。

CD276屬于免疫檢查點(diǎn)分子的B7超家族，其在大多數(shù)正常組織中低表達(dá)，但在各種癌癥，包括乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌等組織中明顯高表達(dá)[5,6]。大量研究表明，CD276過(guò)表達(dá)與胰腺、乳腺、結(jié)直腸、肝臟、前列腺癌、肝內(nèi)膽管癌、口腔鱗癌的增殖和侵襲潛能相關(guān)[8,9]。在許多癌癥中，CD276的過(guò)表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)[10,11]。但是，在胃癌和胰腺癌患者中，高表達(dá)CD276則與更好的生存率密切相關(guān)[12,13]。導(dǎo)致這種差異可能與不同的癌癥類型(或亞型)、腫瘤異質(zhì)性、不同的樣本量、臨床分期、CD276測(cè)定的時(shí)間點(diǎn)以及研究中使用的不同方法有關(guān)。

轉(zhuǎn)移侵襲是惡性腫瘤的基本特征和重要標(biāo)志，也是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。研究表明，超過(guò)80%的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移。鑒于此，本研究主要著眼于CD276對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。

腫瘤轉(zhuǎn)移首先表現(xiàn)為細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。因此，在本文中，我們首先通過(guò)劃痕法檢測(cè)了過(guò)表達(dá)或敲低CD276的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CD276蛋白可明顯增強(qiáng)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的遷移能力，而敲低CD276的表達(dá)則可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞T-47D的遷移能力。Transwell結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CD276蛋白可明顯增強(qiáng)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的侵襲能力，而敲低CD276的表達(dá)則可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞T-47D的侵襲能力。由此我們推測(cè)，CD276可促進(jìn)細(xì)胞的遷移及侵襲，并進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[14]。上皮細(xì)胞通過(guò)EMT獲得間充質(zhì)特性，使腫瘤細(xì)胞能夠克服內(nèi)皮屏障，通過(guò)血液或淋巴循環(huán)向其他器官遷移[15]。在EMT過(guò)程中，細(xì)胞丟失上皮標(biāo)志因子，如E-cadherin等，而相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子包括Slug、Twist、Snail等家族會(huì)被激活[16]。Snail 家族成員 Snail1 和 Snail2(Slug)等參與了與細(xì)胞分化和生存相關(guān)的各種過(guò)程，對(duì)于腫瘤發(fā)生起重要作用。Snail 是可直接抑制 E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄的重要因子，可誘導(dǎo) EMT的發(fā)生[17,18]。Snail1 及 Slug 能夠抑制 E-鈣黏蛋白表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明CD276促進(jìn)細(xì)胞的遷移及侵襲的機(jī)制，我們通過(guò)Western blot方法檢測(cè)了CD276對(duì)E-cadherin、Snail及Slug表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在MCF-10A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD276可抑制侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)Snail和Slug的表達(dá)；而在T-47D細(xì)胞中敲低CD276的表達(dá)可促進(jìn)侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，抑制Snail和Slug的表達(dá)。

本研究結(jié)果提示，CD276蛋白除了在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，還可通過(guò)促進(jìn)EMT增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究可以為進(jìn)一步研究CD276的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也將為乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療提供新的靶點(diǎn)。