張逢源，劉曉燕，葉為春，張海霞

(1.蘭州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

利用熒光分析法，熒光探針通過化學(xué)專屬性反應(yīng)達(dá)到分析檢測的目地. 受體分子與目標(biāo)分析物作用后，熒光光譜的強(qiáng)度、最大發(fā)射位置等發(fā)生改變，特異識別和測量目標(biāo)物. 相較于離子色譜法[1-2]和電化學(xué)法[3-6]，熒光光譜法具有操作簡單、靈敏度高、背景干擾低、可視化和能成像等優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)原位檢測上更具優(yōu)勢，成為了目前最活躍的檢測方法之一[7-15].

利用一種熒光探針對多種組分進(jìn)行檢測，是一個(gè)經(jīng)濟(jì)、實(shí)用和高效的方法. 首先通過一鍋法合成探針5,10,15,20-四對羥苯基卟啉(THPP)，然后利用紅外光譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征. 采用紫外-可見分光光度計(jì)和熒光光譜儀對熒光探針THPP與各種離子的響應(yīng)進(jìn)行了光譜性質(zhì)的研究. 研究結(jié)果可以轉(zhuǎn)化為一個(gè)代表性綜合實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)操作不僅鍛煉了學(xué)生有機(jī)合成的技術(shù)，而且還可以掌握紫外-可見分光光度計(jì)和熒光光譜儀等儀器的使用以及數(shù)據(jù)處理的方法. 同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)包括了有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、儀器分析及無機(jī)化學(xué)等多個(gè)學(xué)科的知識點(diǎn)及多種重要的操作技術(shù). 在大學(xué)開設(shè)綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的就是為了讓學(xué)生將大學(xué)階段所學(xué)習(xí)的所有化學(xué)課程的知識運(yùn)用到實(shí)際的科學(xué)研究中，鞏固基本實(shí)驗(yàn)操作技能，提高分析解決問題的能力，所以將科研成果轉(zhuǎn)化到本科教學(xué)中，對教學(xué)科研都具有積極地意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Bruker Daltonics APEXII 47e FT-ICR型質(zhì)譜儀(美國)；400 MHz核磁共振儀(日本)；RF-5301pc熒光光譜儀(日本)；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)(中國)；溶液pH值利用PHSJ-3F型pH計(jì)測定(中國).

1.2 試劑

硝基苯，丙酸，4-羥基苯甲醛，吡咯，石油醚，乙酸乙酯，二甲基亞砜(DMSO)，九水合硝酸鐵，九水合硝酸鋁，六水合硝酸鋅，三水合硝酸銅，一水合硝酸鈣，六水合硝酸鎂，硝酸鋇，硝酸鈉，硝酸鉀，硝酸銀，六水合硝酸鎳，四水合硝酸鎘，氯化汞，硝酸鉛，碳酸鈉，錯(cuò)酸鈉，高氯酸鈉，硫酸鈉，亞硫酸鈉，硝酸鈉，亞硝酸鈉，氟化鈉，氯化鈉，溴化鈉，碘化鈉，焦磷酸鈉(PPi)，磷酸鈉(Pi)，堿性磷酸酶(ALP)，所有試劑均為市售分析純.

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 THPP的合成與表征

此步驟包括兩次實(shí)驗(yàn)：(1)第一次實(shí)驗(yàn)為合成探針并得到粗產(chǎn)品. 室溫下，將12 mL硝基苯與38 mL丙酸混合攪拌30 min，在混合物中加入1.22 g 4-羥基苯甲醛(0.01 mol)和0.67 g吡咯(0.01 mol). 繼續(xù)攪拌1.5 h后加入10 mL 石油醚終止反應(yīng)，將反應(yīng)體系置于-20 ℃冷凍[16].

(2)第二次實(shí)驗(yàn)為提純產(chǎn)品和表征. 將上述冷凍樣品過濾，使用石油醚洗滌沉淀. 使用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行索氏提取純化沉淀，得到深藍(lán)色純品(產(chǎn)率65%). 對樣品進(jìn)行紅外光譜、核磁共振和高分辨質(zhì)譜表征，解析譜圖，確認(rèn)結(jié)構(gòu).

2.2 光譜檢測

此步驟包括兩次實(shí)驗(yàn)：(1)第三次實(shí)驗(yàn)為Cu2+的測定，包括定量和選擇性實(shí)驗(yàn)[16]. 配制1.0 mmol/L THPP的DMSO儲備液. 制備下列離子的10 mmol/L的水溶液. 除Cu2+作為分析物外，其它離子包括Fe3+、Al3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、K+、Ag+、Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+作為干擾物.

在離心管中依次加入20 μL THPP儲備液，20 μL金屬離子的水溶液，最終溶劑體系為50 mmol/L HEPES緩沖溶液(pH=7.4)與DMSO，體積比1∶1. 在以后的光譜實(shí)驗(yàn)中，仍然使用該溶劑體系. 實(shí)驗(yàn)體系為2 mL，搖勻，室溫放置30 min，分別用熒光和紫外-可見分光光度計(jì)記錄光譜信息.

10 μmol/L THPP與不同濃度的Cu2+混合，制作Cu2+工作曲線，建立Cu2+的熒光分析方法.

光譜實(shí)驗(yàn)使用的體系、探針和離子濃度同第三次實(shí)驗(yàn).

在配合物THPP-Cu2+的體系(10 μmol/L)中加入0～1 000 μmol/L的PPi，制作工作曲線，建立PPi的熒光分析方法.

ALP的測定：將不同濃度的ALP(0～100 U/mL)分別與500 μmol/L PPi混合, 再將混合溶液加入到THPP-Cu2+中，制作工作曲線，建立ALP的熒光分析方法.

該工作中熒光測試條件為激發(fā)波長：λex/em=560/657 nm，狹縫寬度：5/5 nm.

3 結(jié)果與討論

3.1 探針THPP的合成及結(jié)構(gòu)表征

探針THPP合成路線如圖1所示[16]. 產(chǎn)物經(jīng)過不同表征手段，證實(shí)結(jié)構(gòu)正確. 通過紅外光譜很容易找到苯環(huán)和羥基官能團(tuán)，核磁共振譜證實(shí)不同類型的H和C存在. 高分辨質(zhì)譜證明其分子量.

3.2 探針的光譜性質(zhì)的研究

3.2.1 Cu2+檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明THPP與不同金屬離子的配位能力不同，在相同的條件下，THPP與銅離子作用力最強(qiáng)，形成的配合物可以猝滅探針熒光，利用此現(xiàn)象可以檢測銅離子. 同時(shí)，紫外吸收光譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銅離子改變了THPP的吸收光譜，溶液顏色發(fā)生變化，由深粉色變?yōu)闇\黃色，因此銅離子也可以通過顏色變化得到可視檢測. 可以要求學(xué)生建立熒光和紫外分光光度法，比較兩種方法定量的線性范圍.

圖1 THPP的合成Fig. 1 Synthesis of THPP

利用THPP與Cu2+的配位反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)Cu2+的定量分析. 隨著Cu2+的加入，體系在657 nm波長處的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，最終完全猝滅. 探針(10 μmol/L)熒光強(qiáng)度的降低率((I0-I)/I0)與Cu2+(1.0～6.0 μmol/L)的濃度呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系，可以確定該濃度范圍內(nèi)未知水樣品中Cu2+含量.

3.2.2 PPi檢測

PPi 是三磷酸腺苷的水解產(chǎn)物，通過參與酶催化反應(yīng)，起到能量轉(zhuǎn)導(dǎo)及重要的代謝作用[16]. 所以檢測PPi有很重要的意義. 在THPP-Cu2+的體系中加入不同的陰離子，只有PPi使體系熒光強(qiáng)度得到恢復(fù)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，其他陰離子沒有干擾. 在紫外燈(365 nm)照射下，可以觀察到體系的紅色熒光. 同樣吸收光譜發(fā)生了明顯的變化，在650 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，與THPP的紫外吸收峰重疊，溶液顏色由淺黃色變成深粉色，能證明PPi與Cu2+配位，釋放出THPP，熒光重新出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)對PPi的可視檢測. 所以可以建立熒光和紫外兩種分析方法測定PPi.

在THPP-Cu2+體系中加入PPi，隨著PPi濃度的增加，657 nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng). 濃度為500 μmol/L PPi時(shí)，達(dá)到飽和，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生改變. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)THPP-Cu2+體系的熒光強(qiáng)度與PPi濃度(5～50 μmol/L)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可以定量該濃度范圍內(nèi)的PPi.

3.2.3 ALP檢測

ALP是一種酶催化劑，可以水解PPi為Pi，由于Pi無法使THPP-Cu2+的熒光強(qiáng)度恢復(fù)，隨著ALP的加入，THPP-Cu2+-PPi的熒光強(qiáng)度減弱，從而達(dá)到檢測ALP的目的. THPP-Cu2+-PPi與ALP(0.1-1.0 U/mL)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，可以間接測定ALP.

4 結(jié)論

科研成果轉(zhuǎn)化成本科綜合實(shí)驗(yàn)，需要實(shí)驗(yàn)符合本科生的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，符合本科生的操作難度，能有效將不同學(xué)科的知識點(diǎn)串聯(lián)起來. 這個(gè)研究成果設(shè)計(jì)的綜合實(shí)驗(yàn)，滿足上述要求. 新型的近紅外熒光探針THPP，是進(jìn)行細(xì)胞和活體成像的優(yōu)選探針，通過該探針的合成，展現(xiàn)給學(xué)生學(xué)科的發(fā)展前沿，鍛煉他們合成與純化、表征的能力. 通過光譜儀器，利用非常簡便的方法來靈敏檢測Cu2+、PPi及ALP，讓學(xué)生建立了選擇性、線性范圍的概念，也讓學(xué)生了解如何有效利用一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu). 實(shí)際上，該探針可以用于細(xì)胞成像，測定細(xì)胞中相關(guān)物質(zhì)，但是由于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞成像，超出了本科生的實(shí)驗(yàn)范圍，故實(shí)驗(yàn)僅僅涉及了體外檢測部分.

通過本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)，使學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)了從設(shè)計(jì)、合成、表征到定量檢測的全部過程，學(xué)會了熒光光譜儀和紫外-可見分光光度計(jì)等儀器的使用，并且掌握了物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法. 此外，熒光檢測中溶液顏色的變化以及熒光的猝滅和產(chǎn)生，激發(fā)了學(xué)生對于科學(xué)研究的極大興趣. 此綜合實(shí)驗(yàn)潛移默化的將有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、儀器分析及無機(jī)化學(xué)等知識進(jìn)行融會貫通，對高年級學(xué)生的畢業(yè)論文設(shè)計(jì)以及今后繼續(xù)從事科研工作打下了良好的基礎(chǔ).

上述工作結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證，具有很好的重復(fù)性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以對照張逢源博士論文[16]，驗(yàn)證其正確性. 其中探針測定銅離子的部分內(nèi)容在蘭州大學(xué)本科生的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和綜合實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了實(shí)踐，效果良好.

說明：科研成果主要來自蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院張逢源博士的學(xué)位論文(2019.1).