姜振錕 劉景川 陳善義 李菁菁 何偉 張?jiān)龌? 沈祿恒

摘 要：為明確片煙醇化倉庫倉間空氣中含有的霉菌種類和組成，以龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司東肖煙葉庫3個(gè)倉庫為研究對象，采用空氣微生物采樣器進(jìn)行浮游霉菌采樣，所得的霉菌平板經(jīng)28℃下培養(yǎng)4d后計(jì)數(shù)，挑取菌落并進(jìn)行ITS測序，分析不同煙葉醇化倉庫的倉間空氣浮游霉菌的組成差異。結(jié)果表明，相對濕度大的倉庫，其倉間空氣中含有的霉菌數(shù)量多;3個(gè)倉庫倉間空氣中收集獲得的霉菌共有15個(gè)種，含量占比在25%以上的霉菌為極細(xì)枝孢、枝狀枝孢菌和桔青霉;極細(xì)枝孢為4號庫的優(yōu)勢霉菌，而枝狀枝孢菌為9號庫、13號庫的優(yōu)勢霉菌。

關(guān)鍵詞：霉菌;微生物區(qū)系;片煙;倉儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)

中圖分類號 S572文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-0040-02

在卷煙生產(chǎn)加工過程中，復(fù)烤后的片煙倉儲(chǔ)醇化是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。片煙自然醇化周期較長，通常為12～30個(gè)月[1-3]。空氣中存在著多種霉菌，片煙在倉儲(chǔ)過程易沾染霉菌孢子，由于煙葉中含有霉菌生長所需的蛋白質(zhì)、還原糖等多種營養(yǎng)物質(zhì)，再加上煙葉本身吸濕性強(qiáng)，一旦條件適宜，易發(fā)生霉變[4]，嚴(yán)重影響煙葉的使用價(jià)值。有關(guān)片煙霉變微生物的區(qū)系研究，目前主要集中在片煙本身含有的霉菌，而對于倉儲(chǔ)醇化過程中倉間空氣霉菌的研究甚少。為此，本研究以龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司煙葉倉庫為試驗(yàn)對象，利用空氣微生物采樣器采集倉庫倉間空氣霉菌孢子，分析不同倉庫空氣霉菌的組成差異，旨在為片煙霉變的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基：購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（貨號021115），按廠家說明書配制，121℃下滅菌15min后，冷卻至約65℃時(shí)，向培養(yǎng)基中加入硫酸鏈霉素（終濃度為50μg/mL）。改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（貨號021041），按廠家說明書配制，121℃下滅菌15min。儀器：空氣微生物采樣器（MAS-100NT型，Millipore公司，瑞士）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（CLC-B2V-M/CLC 222-TV型，MMM Group公司，德國）。

1.2 方法 采樣地點(diǎn)位于龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司東肖煙葉倉庫4號（2001年建成，密封條件較差）、9號（2008年建成，密封條件較好）、13號（2010年建成，密封條件中等）醇化庫，所選樓層均為3樓（3個(gè)倉庫總樓層數(shù)均為5層）。以DG18培養(yǎng)基為霉菌收集培養(yǎng)基，利用MAS-100NT空氣采樣器進(jìn)行倉間空氣霉菌采樣，采樣體積為100L，每個(gè)倉庫重復(fù)3次。采樣時(shí)，利用手持式溫濕度儀測量并記錄倉間空氣的溫濕度。采樣結(jié)束后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，所得微生物平板帶回實(shí)驗(yàn)室，于28℃下培養(yǎng)4d后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿上長出的菌落數(shù)。挑取菌落形態(tài)及顏色差異較大的菌落，轉(zhuǎn)移至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)4d。重復(fù)上述傳代過程，直至長出的菌落形態(tài)單一，以實(shí)現(xiàn)菌落的純化。純化好的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行ITS測序，所得序列于GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對。用MEGA X軟件[5]自帶的Clustal W模塊對所得霉菌ITS序列進(jìn)行多重比對。然后通過MEGA X軟件中的Maximum Composite Likelihood模型計(jì)算進(jìn)化距離，利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煙葉醇化倉庫的霉菌數(shù)量 由表1可知，就溫度而言，采樣時(shí)3個(gè)倉庫空氣溫度差異不大。相對濕度方面，4號庫最大、9號庫最小、13號庫居中。相應(yīng)地，4號庫平均的霉菌含量最大、9號庫最小、13號庫居中。3個(gè)倉庫霉菌含量彼此之間差異顯著，且4號庫與其余2個(gè)倉庫差異達(dá)到極顯著水平。這說明倉間空氣中霉菌的含量與空氣相對濕度關(guān)系密切。

2.2 不同煙葉醇化倉庫的霉菌組成差異 由表2～4可知，4號庫倉間空氣含有6種霉菌，分別為極細(xì)枝孢、Cladosporium xanthochromaticum、菌核青霉菌、擬粉紅鎖擲孢酵母、裂褶菌以及小孢擬盤多毛孢，其中極細(xì)枝孢為優(yōu)勢菌，占比為83.58%;9號庫倉間空氣含有5種霉菌，分別為枝狀枝孢菌、短密青霉菌、裂褶菌、小孢擬盤多毛孢以及Penicillium virgatum，其中枝狀枝孢菌為優(yōu)勢菌，占比為81.40%;13號庫倉間空氣含有4種霉菌，分別為枝狀枝孢菌、桔青霉、頂青霉及鮮紅青霉，其中枝狀枝孢菌為優(yōu)勢菌，占比為66.67%。此外，4號、9號庫共同含有的霉菌種類為裂褶菌和小孢擬盤多毛孢，9號、13號庫共同含有的霉菌為枝狀枝孢菌。

2.3 東肖煙葉倉庫倉間空氣中霉菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 由圖1可知，3個(gè)倉庫倉間空氣分離所得菌株共有15個(gè)種。所得的15種霉菌在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成2大分支，其中4號庫的DX4-5菌株獨(dú)立形成1個(gè)大的分支，其余14種霉菌另形成1個(gè)大的分支，說明DX4-5菌株與其余14個(gè)種菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

對比3個(gè)倉庫的溫濕度條件和霉菌數(shù)量可以得知，倉庫條件和倉間環(huán)境的濕度對倉間空氣霉菌數(shù)量的影響較大。倉庫條件好、濕度較低的情況下，空氣中的霉菌數(shù)量明顯少于倉庫條件差、濕度較高的倉庫。因此，控制倉庫的環(huán)境濕度可有效減少空氣中霉菌的數(shù)量，進(jìn)而降低倉儲(chǔ)片煙霉變的風(fēng)險(xiǎn)。ITS測序及BLAST比對結(jié)果表明，極細(xì)枝孢、枝狀枝孢菌和桔青霉為相對的優(yōu)勢霉菌，不同倉庫的倉間空氣霉菌組成有所差異。下一步應(yīng)開展上述優(yōu)勢霉菌的生物學(xué)特性及致霉條件的研究，以期為倉儲(chǔ)片煙的霉變控制提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]陳萬年，宋紀(jì)真，范堅(jiān)強(qiáng)，等.福建和云南烤煙煙片的最佳醇化期及適宜貯存時(shí)間[J].煙草科技，2003（7）：9-12.

[2]齊凌峰，卓思楚，宋紀(jì)真，等.不同產(chǎn)地片煙的最佳醇化期及適宜貯存時(shí)間研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：155-157.

[3]齊凌峰，卓思楚，宋紀(jì)真，等.上部煙葉在廈門的最佳醇化期及適宜貯存時(shí)間[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（1）：106-109.

[4]李春艷，趙高嶺，葉紅朝，等. 河南煙葉倉儲(chǔ)期優(yōu)勢霉菌的分離鑒定及防霉劑的篩選[J].煙草科技，2011（7）：64-68.

[5]Kumar S.， Stecher G.， Li M.， et al. MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J].Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）：1547-1549.

（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（FJZYKJJH2018011）。

作者簡介：姜振錕（1994—），男，福建永定人，助理工程師，從事煙草原料研究工作。劉景川（1988—），男，福建龍巖人，助理農(nóng)藝師，從事煙草原料研究工作。#共同第一作者 *通訊作者? 收稿日期：2019-09-23