劉楠楠，王新明，叢 薇

（1.吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 吉林 132108；2.吉林省吉林市船營(yíng)區(qū)畜牧特產(chǎn)總站，吉林 吉林 132000）

1 引言

眾所周知，長(zhǎng)白山文化歷史悠久，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，在四千多年前的《山海經(jīng)》 中就有對(duì)其最早的文字記載。卓越的自然生態(tài)環(huán)境孕育出極為豐富的動(dòng)植物資源。長(zhǎng)白山是聯(lián)合國(guó)“人與生物圈”自然保留地和國(guó)際A 級(jí)自然保護(hù)區(qū)，是世界上少有的“物種基因庫(kù)”之一。但近年來由于人類活動(dòng)的不斷涉入和生態(tài)環(huán)境的持續(xù)惡化，使得長(zhǎng)白山區(qū)瀕危物種越來越多，長(zhǎng)白山中華蜜蜂（以下簡(jiǎn)稱長(zhǎng)白山中蜂） 就是其中瀕危程度較高的珍稀物種之一。

中華蜜蜂品種瀕?，F(xiàn)象已經(jīng)證明，蜜蜂種質(zhì)資源的保護(hù)工作是養(yǎng)蜂生產(chǎn)亟待解決的重要問題。為了搶救和保護(hù)這一瀕危物種，應(yīng)當(dāng)對(duì)長(zhǎng)白山中華蜜蜂的種質(zhì)資源進(jìn)行有效保護(hù)，在充分了解目前種群現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，建立準(zhǔn)確的遺傳譜系，以避免或減少近親交配帶來的種群衰退，保持好種群的遺傳多樣性，并展開基礎(chǔ)性研究工作，深入挖掘這一珍稀資源重要經(jīng)濟(jì)性狀和品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的優(yōu)異基因，為日后開展長(zhǎng)白山中蜂的分子輔助育種和遺傳改良提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

2 生存現(xiàn)狀

長(zhǎng)白山中蜂是中華蜜蜂家族中一個(gè)優(yōu)良的地方蜂種，屬于中華蜜蜂的東北生態(tài)型，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的蜜蜂品種，被列入《國(guó)家級(jí)畜禽品種資源保護(hù)名錄》[1]，不同于南方中蜂的獨(dú)特生物學(xué)特性和生產(chǎn)性能。具體表現(xiàn)為抗寒、抗病、抗螨等特殊的生產(chǎn)性狀，不僅個(gè)體大、耐大群，而且采集力強(qiáng)、產(chǎn)蜜量高，且飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益不低于西方蜜蜂。在南方中蜂蜂場(chǎng)遭遇囊狀幼蟲病滅頂之難時(shí)，長(zhǎng)白山中蜂則安然無恙，足以說明其優(yōu)良的性狀表現(xiàn)和含有的優(yōu)異基因。

長(zhǎng)白山中蜂處于瀕危狀態(tài)，究其主要原因有以下幾方面。一方面，改革開放以后，由于西方蜜蜂的大量引進(jìn)，蜂農(nóng)看到了更明顯的經(jīng)濟(jì)效益，再加上外來的轉(zhuǎn)地放蜂，擠占了長(zhǎng)白山中蜂的生存空間。另一方面，長(zhǎng)白山中蜂在與西方蜜蜂的種間競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，主要表現(xiàn)在食物競(jìng)爭(zhēng)、盜蜂侵襲和交尾干擾等方面，導(dǎo)致生態(tài)一度失衡，還有毀巢、殺蜂、取蜜等人為的故意破壞，導(dǎo)致種群數(shù)量銳減。另外，近年中蜂蜜以其特有的無公害、原生態(tài)等特點(diǎn)備受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)供不應(yīng)求，致使一些蜂農(nóng)只顧效益不重保護(hù)，大面積毀滅長(zhǎng)白山中蜂資源。由此，人們意識(shí)到寶貴的種質(zhì)資源已經(jīng)進(jìn)入瀕危甚至滅種狀態(tài)，采取多種措施加強(qiáng)對(duì)長(zhǎng)白山中蜂品種資源的保護(hù)，目前雖已稍現(xiàn)復(fù)蘇跡象，但存在的問題依然突出。

3 種群資源的保護(hù)

其工作是在開展種質(zhì)資源保護(hù)、鑒定、評(píng)價(jià)和利用的前提和基礎(chǔ)，提出以下幾點(diǎn)建議。

3.1 建立長(zhǎng)白山中蜂保護(hù)區(qū)

在保護(hù)區(qū)溝口、路口設(shè)置醒目的標(biāo)志牌，對(duì)保護(hù)區(qū)實(shí)行重點(diǎn)保護(hù)管理措施和技術(shù)管理措施，保證長(zhǎng)白山中蜂的純度和穩(wěn)定性。

3.2 保種和選種

保護(hù)區(qū)內(nèi)只飼養(yǎng)1 個(gè)類型的長(zhǎng)白山中蜂，每年在育王季節(jié)選擇高產(chǎn)抗病良種作種群，在嚴(yán)密隔離的交尾條件下逐步實(shí)行閉鎖繁育，利用優(yōu)良群作母本和父本培育優(yōu)良蜂王，提高長(zhǎng)白山中蜂保種的技術(shù)水平和保種效率。

3.3 建立遺傳資源檔案

對(duì)每一時(shí)期的長(zhǎng)白山中蜂父本和母本的血統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)原始記錄，禁止引進(jìn)外地或來源不明的中蜂群、中蜂王等。

3.4 鼓勵(lì)蜂農(nóng)飼養(yǎng)長(zhǎng)白山中蜂

加強(qiáng)對(duì)長(zhǎng)白山中蜂的研究和選育，在保持中蜂蜂巢結(jié)構(gòu)和傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式的前提下，提高飼養(yǎng)效益，鼓勵(lì)和吸引更多的蜂農(nóng)飼養(yǎng)中蜂，使保護(hù)區(qū)內(nèi)長(zhǎng)白山的中蜂繁衍昌盛。

4 種質(zhì)遺傳多樣性的保護(hù)

實(shí)踐證明，充分了解物種種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多態(tài)性現(xiàn)狀，建立遺傳譜系可以最大限度地減少近親繁殖，保持遺傳多樣性，進(jìn)而保護(hù)整個(gè)物種。因此，建立相關(guān)的親子關(guān)系鑒定技術(shù)防止在育種的過程中出現(xiàn)近交衰退，為長(zhǎng)白山中蜂種群的結(jié)構(gòu)分析、物種生存策略指導(dǎo)以及制定有效的保護(hù)措施等方面提供依據(jù)。

4.1 微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)應(yīng)用于長(zhǎng)白山中華蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)的研究展望

4.1.1 利用微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)對(duì)長(zhǎng)白山中蜂家族系譜進(jìn)行有效的修改和完善

微衛(wèi)星序列屬于共顯性遺傳，進(jìn)行種內(nèi)和近緣物種間親緣關(guān)系分析的基礎(chǔ)是微衛(wèi)星序列的豐富多態(tài)性和穩(wěn)定保守性[2]，因此在物種的種質(zhì)鑒定中具有一定的優(yōu)越性，已成功在多個(gè)瀕危動(dòng)物育種中得到了應(yīng)用。

當(dāng)前，在昆蟲群落中測(cè)量個(gè)體間的親緣關(guān)系是近年來生物社會(huì)學(xué)的一個(gè)主要課題，這些測(cè)量被認(rèn)為是評(píng)估和測(cè)試當(dāng)前親屬選擇理論和昆蟲社會(huì)性進(jìn)化的關(guān)鍵。蜜蜂具有高度復(fù)雜的多態(tài)性社會(huì)結(jié)構(gòu)，微衛(wèi)星應(yīng)用于親子鑒定的分子標(biāo)記，不僅可以用于指導(dǎo)動(dòng)物種群譜系的建立，也是研究社會(huì)性昆蟲社會(huì)結(jié)構(gòu)進(jìn)化和親緣識(shí)別機(jī)制的有利技術(shù)手段。微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)應(yīng)用于蜜蜂、螞蟻、熊蜂等社會(huì)學(xué)昆蟲的研究國(guó)外已有相關(guān)報(bào)道，Annette B.Jensen 等[3]利用11 個(gè)DNA 微衛(wèi)星基因座標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行基因分型，親子關(guān)系分析，以確定交配距離，在16 只工蜂后代中平均檢出10.2 只父本，確定了英國(guó)國(guó)家公園2 個(gè)相鄰的半隔離山谷中西方蜜蜂的交配范圍，以評(píng)估它們對(duì)本地蜜蜂保護(hù)和隔離交配地點(diǎn)的適用性，確認(rèn)此地是長(zhǎng)期保護(hù)的蜜蜂繁殖種群的一個(gè)合適位置。Kevin R.Foster 等[4]進(jìn)行了黃蜂的親子關(guān)系、繁殖與沖突的研究，建立了親緣選擇預(yù)測(cè)模型系統(tǒng)；Helge SCHLüNSa 等[5]對(duì)7種蜜蜂的親子不對(duì)稱現(xiàn)象進(jìn)行了研究，利用已有文獻(xiàn)中的樣本量校正方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新分析，以調(diào)查西方蜜蜂物種間親緣關(guān)系的差異和相似性；Duan Paál 等[6]利用14 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，利用適當(dāng)優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)，評(píng)估了斯洛伐克蜜蜂的群體結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、品種分配以及蜜蜂蜂王的親子鑒定；Else J.Fjerdingstad 等[7]開發(fā)了二核苷酸微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記，詳細(xì)研究巴拿馬切葉蟻群體中的多重親子關(guān)系的程度；N.CHLINE[8]用17 個(gè)微衛(wèi)星基因座分析雄蜂蛹，討論所有的雄蜂是否都是工蜂的后代，以及還有多少工蜂和個(gè)體工蜂繁殖了它們，結(jié)果表明其中大部分工蜂的后代來自同一個(gè)父系；K.Palmer 等[9]從蘇拉威西采集的成年工蜂的樣本中利用微衛(wèi)星標(biāo)記估計(jì)4 個(gè)蘇威拉西蜂王的親子頻率，研究結(jié)果表明其在種內(nèi)交配頻率較高；C.M.Payne 等[10]基于B10 基因座微衛(wèi)星DNA 的熊蜂群體進(jìn)行多重親子關(guān)系的研究，表明B10 基因座在北美熊蜂中表現(xiàn)出較高的種間擴(kuò)增成功率，4 個(gè)熊蜂屬的1 個(gè)種屬有1 個(gè)以上的父親，1 個(gè)擬熊蜂屬擁有1 個(gè)以上的父系血統(tǒng)；D.R.Tarpy 和D.I.Nielsen[11]綜述了蜜蜂群體內(nèi)親子鑒定的研究文獻(xiàn)，并報(bào)道了8 種蜜蜂的平均親本數(shù)量和有效親子頻率，采用最近開發(fā)的有效親子鑒定，證明其對(duì)平均親子鑒定的影響不大，但它可以對(duì)個(gè)體估計(jì)的方差產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，建議未來的實(shí)證研究報(bào)告這一新的樣本統(tǒng)計(jì)及其相關(guān)的方差，以減少抽樣誤差對(duì)個(gè)體親子鑒定的固有影響?？梢?，微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)應(yīng)用在國(guó)外的相關(guān)社會(huì)學(xué)昆蟲的研究中已經(jīng)取得了相當(dāng)程度的研究進(jìn)展，為其應(yīng)用于長(zhǎng)白山中蜂種群提供了有益的借鑒。

4.1.2 利用微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)對(duì)進(jìn)一步揭示蜜蜂一雌多雄交配的機(jī)制提供有利手段

了解雌性多重交配的進(jìn)化，是社會(huì)昆蟲行為學(xué)中的重要問題，親緣選擇已成為昆蟲社會(huì)進(jìn)化最為廣泛接受的解釋。然而，在膜翅目社會(huì)性昆蟲（螞蟻、蜜蜂和黃蜂） 中所面對(duì)的1 個(gè)問題是一雌多雄現(xiàn)象的存在，了解哪些選擇因素可能有利于多重交配和多重親子關(guān)系，需要詳細(xì)研究其種內(nèi)模式的親子關(guān)系，這就需要精確的遺傳標(biāo)記。因此，利用微衛(wèi)星親子鑒定可以為社會(huì)性昆蟲多重交配的深入研究提供技術(shù)支撐，從而揭示一雌多雄機(jī)制的產(chǎn)生。

蜜蜂在社會(huì)性昆蟲中具有多重交配的最高水平，蜂群包含1 只唯一的蜂王，它可以與10～20 只雄蜂交配，這導(dǎo)致了蜂群基因型的異質(zhì)性。目前有3 種學(xué)說解釋蜜蜂的一雌多雄交配現(xiàn)象，分別是遺傳變異學(xué)說、性位點(diǎn)學(xué)說和獲得足夠精子學(xué)說[12]。蜂王的多重交配顯著降低了雌性同伴的平均遺傳關(guān)聯(lián)性，隨后廣泛影響了蜂群的社會(huì)行為。在過去的幾十年中，現(xiàn)代分子技術(shù)使研究人員能夠更準(zhǔn)確地估計(jì)個(gè)體蜂王的交配數(shù)量。蜂王的交配數(shù)通常是通過確定它的工蜂后代的基因型和列出不同父系標(biāo)記來推斷的，而對(duì)遺傳相關(guān)和社會(huì)行為的重要影響是蜂王的親子頻率，具體地說，來自蜂群的工蜂后代的實(shí)驗(yàn)樣本導(dǎo)致取樣誤差和非檢測(cè)誤差。這些不確定性導(dǎo)致一些研究人員得出結(jié)論，目前對(duì)蜜蜂有效親子頻率的估計(jì)是保守的。W.O.H.HUGHES 等[13]進(jìn)行241 種社會(huì)性昆蟲的一雌多雄制與一雄多雌制關(guān)系的比較研究，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育控制之后一雌多雄制與一雄多雌制有顯著負(fù)相關(guān)，當(dāng)物種沒有通過一雄多雌制獲得更高的群體內(nèi)遺傳多樣性，并且這些益處超過性狀的成本時(shí)，多雌制隨之進(jìn)化，性選擇和性沖突可能扮演一個(gè)關(guān)鍵的角色，卻在社會(huì)進(jìn)化研究中往往被忽視。Jun-ichi Takahashi 等[14]利用DNA 微衛(wèi)星技術(shù)，進(jìn)行馬來西亞黑矮蜂一雌多雄水平的研究，對(duì)200 個(gè)工蜂蛹和每個(gè)蜂群的蜂王交配頻率進(jìn)行了檢測(cè)；David R.Tarpy 等[15]研究表明：一雌多雄制的1 個(gè)主要后果是群體內(nèi)的基因型的多樣性增加，這已被經(jīng)驗(yàn)證明賦予顯著的適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)，從而導(dǎo)致更高的群體生產(chǎn)力和存活率；P.Neumann 和R.F.A.Moritz[16]進(jìn)行了蜜蜂一雌多雄進(jìn)化的遺傳方差檢驗(yàn)假設(shè)研究，在4 個(gè)DNA 微衛(wèi)星位點(diǎn)上對(duì)每個(gè)群體的工蜂進(jìn)行基因分型，以確定群體一雌多雄的水平，沒有發(fā)現(xiàn)一雌多雄水平與蜂群的產(chǎn)蜜量、大小和寄生蟲負(fù)荷的平均影響，可以導(dǎo)致產(chǎn)生更具生產(chǎn)力的蜂群表型。如果說群體水平選擇是一雌多雄制的進(jìn)化力量，那么在自然交配的蜂王為首的人工育種蜂群中則很難發(fā)現(xiàn)這種影響。S.Fuchs 和V.Schade[17]發(fā)現(xiàn)具有混合親子關(guān)系的工蜂表現(xiàn)出群體優(yōu)勢(shì)，可能促進(jìn)蜜蜂蜂王一雌多雄的進(jìn)化，蜜蜂蜂群的多重交配比單一交配更具有群體優(yōu)勢(shì)，最終會(huì)導(dǎo)致繁殖性能更高。因此，可以得出結(jié)論，蜂群更高的繁殖產(chǎn)量與工蜂基因多樣性增加可能是一雌多雄制演變的主要驅(qū)動(dòng)力。

4.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用于長(zhǎng)白山中華蜜蜂優(yōu)異基因挖掘的研究展望

大數(shù)據(jù)的全基因組時(shí)代已經(jīng)到來，全基因組關(guān)聯(lián)分析（以下簡(jiǎn)稱GWAS） 技術(shù)成為當(dāng)前科技人員廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)。它最先應(yīng)用于人類疾病的研究，為復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供了線索和幫助。之后，又陸續(xù)應(yīng)用于多種經(jīng)濟(jì)作物和畜禽等動(dòng)植物資源的基因挖掘和功能基因的驗(yàn)證研究中。相關(guān)研究表明，它對(duì)質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀均有較好的研究結(jié)果，不僅可用于尋找和鎖定與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的功能基因，還可以鑒定QTL[18]。

長(zhǎng)白山中華蜜蜂在古老的長(zhǎng)白山脈下孕育生長(zhǎng)，經(jīng)過漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化選擇和滄桑巨變的生態(tài)環(huán)境影響，形成了極為豐富的種質(zhì)遺傳多樣性，蘊(yùn)含著大量的優(yōu)秀基因。長(zhǎng)期的養(yǎng)蜂生產(chǎn)實(shí)踐中，鑒定出來許多的優(yōu)良性狀，主要有：產(chǎn)卵力強(qiáng)，對(duì)外界氣候、蜜源敏感，能夠按照蜜粉源情況調(diào)節(jié)育蟲數(shù)量；采集力強(qiáng)，善于利用零散蜜源，分蜂性依居住環(huán)境的大小而變化，能維持和穩(wěn)定群勢(shì)；耐寒性強(qiáng)，越冬安全，飼料消耗少；抗螨力強(qiáng)，一般不患蜂螨病。

相比其他物種，GWAS 技術(shù)應(yīng)用在昆蟲的起步較晚，中華蜜蜂又是我國(guó)土生土長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)蜂種，而長(zhǎng)白山中華蜜蜂又是中華蜜蜂大家族中不可或缺的一員，有著其他地方蜂種無法比擬的優(yōu)異性狀表現(xiàn)，因此開展長(zhǎng)白山中蜂的功能基因挖掘和驗(yàn)證是分子育種的重要前提和基礎(chǔ)。目前，在果蠅等其他模式昆蟲GWAS技術(shù)的應(yīng)用研究中已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)還沒有將GWAS 技術(shù)應(yīng)用于蜜蜂研究領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道[19]。西方蜜蜂和東方蜜蜂的全基因組序列的測(cè)序工作已經(jīng)相繼完成，大量的SNP 標(biāo)記被開發(fā)出來，為GWAS 技術(shù)在長(zhǎng)白山中蜂上的應(yīng)用提供了前期基礎(chǔ)和可行性。因此，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)和相關(guān)基因型分析方法，建立基于長(zhǎng)白山中蜂資源的GWAS 技術(shù)，尋找和確定與其重要經(jīng)濟(jì)性狀和優(yōu)異品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因位點(diǎn)，可為中華蜜蜂遺傳學(xué)研究和育種提供重要的基礎(chǔ)，對(duì)現(xiàn)有蜂群進(jìn)行遺傳改良，可為長(zhǎng)白山中蜂種質(zhì)資源的保護(hù)與利用工作帶來切實(shí)可見的改變。

因此，隨著GWAS 技術(shù)的不斷成熟與發(fā)展，我們有理由相信：在不遠(yuǎn)的將來必將在中華蜜蜂優(yōu)異生產(chǎn)性狀基因的開發(fā)和利用方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用，進(jìn)一步擴(kuò)大長(zhǎng)白山中蜂種群的優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)力，更好地保護(hù)、挽救、發(fā)掘和利用珍稀的長(zhǎng)白山中蜂優(yōu)異基因資源。

5 結(jié)語(yǔ)

蜜蜂是重要的授粉昆蟲，在實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收和維護(hù)生態(tài)平衡中發(fā)揮著主要作用。因此，對(duì)于瀕臨滅絕的長(zhǎng)白山中華蜜蜂資源開展保護(hù)性的研究工作勢(shì)在必行，人為干預(yù)是保護(hù)長(zhǎng)白山中蜂資源的必要手段，如果不及時(shí)制定一個(gè)長(zhǎng)期有效的保護(hù)和挽救措施，長(zhǎng)白山中蜂的毀滅將不可避免。因此，科學(xué)、長(zhǎng)遠(yuǎn)地規(guī)劃長(zhǎng)白山中蜂資源，修復(fù)、鞏固、提高現(xiàn)有種群的種質(zhì)資源，保持物種的遺傳多樣性，開展科學(xué)的種質(zhì)資源保護(hù)方面的基礎(chǔ)性研究就顯得必要而迫切。

綜上所述，開發(fā)和建立基于長(zhǎng)白山中蜂的微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，將其應(yīng)用于長(zhǎng)白山中蜂的遺傳多樣性保護(hù)以及重要經(jīng)濟(jì)和品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)優(yōu)異基因的挖掘是進(jìn)行長(zhǎng)白山中華蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)的基礎(chǔ)性研究和前瞻性研究，不僅可以充分了解現(xiàn)有長(zhǎng)白山中蜂種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多態(tài)性情況，還可以為現(xiàn)有長(zhǎng)白山中蜂種群的遺傳改良和創(chuàng)新利用提供一定理論依據(jù)和技術(shù)支撐，進(jìn)而為養(yǎng)蜂生產(chǎn)實(shí)踐提供服務(wù)和指導(dǎo)，同時(shí)也為其他蜜蜂珍稀品種資源的保護(hù)和利用提供借鑒與思路。