馮雨晴,李亞飛,2,史宏志*,周 駿,白若石,馬雁軍,林淑貞
1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心,鄭州市金水區(qū)文化路95 號(hào) 450002
2. 河南經(jīng)貿(mào)職業(yè)學(xué)院,鄭州市鄭東新區(qū)龍子湖北路58 號(hào) 450018
3. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠(chǎng),北京市通州區(qū)萬(wàn)盛南街99 號(hào) 100024
白肋煙煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)和安全性對(duì)卷煙品質(zhì)有較大影響。Lewis 等[1]研究表明,白肋煙Yb 基因突變導(dǎo)致其煙葉色素含量低,光合作用弱,含碳化合物含量低,易出現(xiàn)煙葉硝酸鹽大量積累和氮素利用率低等問(wèn)題[2-3]。煙草葉片中的硝酸鹽是煙葉和煙氣中煙草特有亞硝胺(TSNAs)的重要前體物,且煙葉硝酸鹽含量與TSNAs 積累呈顯著直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系[4-6]。因此,減少煙葉中硝酸鹽積累量對(duì)降低煙葉TSNAs 形成和提高卷煙安全性具有重要意義。有研究表明,煙葉硝酸鹽含量與碳氮代謝密切相關(guān)[7-8],氮還原同化能力弱和物質(zhì)能量供應(yīng)不足是引起白肋煙煙葉硝酸鹽積累的主要原因[9]??梢?jiàn),提高煙葉光合碳固定和氮同化能力是降低煙葉硝酸鹽含量的重要途徑。
鉬素(Mo)是煙草生長(zhǎng)必需的微量元素,且鉬是醛氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、黃嘌呤脫氫酶等的組成成分,能促進(jìn)植物色素合成,對(duì)煙草氮素營(yíng)養(yǎng)吸收及提高煙葉葉綠素含量和穩(wěn)定性、增強(qiáng)光合能力、促進(jìn)碳水化合物合成轉(zhuǎn)移和提高作物產(chǎn)量等有重要作用[10-12]。硝酸還原酶(NR)是一種水溶性鉬黃蛋白,參與硝態(tài)氮還原為氨的過(guò)程,且有利于蛋白質(zhì)合成,而鉬素作為NR 的必須組分,直接影響NR 活性。因此,鉬在氮代謝過(guò)程中起著核心作用[13-14]。植物缺鉬癥狀與缺氮癥狀較為相似,推測(cè)是由于缺鉬導(dǎo)致NR 活性喪失,造成氮素還原作用異常,氮素同化作用受影響,進(jìn)而呈現(xiàn)出類(lèi)似缺氮的癥狀[15-16]。施鉬可提高烤煙生長(zhǎng)發(fā)育中前期葉綠素含量,增加光合速率,從而促進(jìn)光合產(chǎn)物的形成,提高煙葉產(chǎn)量[17-19]。同時(shí),施鉬對(duì)植物葉片NR 有激活作用,能促進(jìn)植物氮代謝,降低植物體內(nèi)硝酸鹽含量,提高氮肥利用效率[20-21]。煙草中鉬是通過(guò)土壤以鉬酸根離子的形式被根系吸收利用,而通過(guò)葉面噴施煙草葉片也可以吸收鉬,且比根系吸收更快[17]。李亞飛等[22]研究表明,施用鉬酸銨能提高烤煙煙葉NR 活性,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成;秦亞光等[23]研究發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),隨著施鉬量的增加,烤煙硝酸鹽含量降低;廖曉勇等[24]研究提出,施鉬對(duì)煙草農(nóng)藝性狀的各項(xiàng)指標(biāo)均有促進(jìn)作用;崔國(guó)明等[12]試驗(yàn)認(rèn)為,烤煙施Mo 能促進(jìn)煙株生長(zhǎng),協(xié)調(diào)煙株生理代謝,增加煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值,改善煙葉品質(zhì)。同時(shí),國(guó)外的一些研究也表明,Mo 在植物氮素代謝過(guò)程中扮演著重要的角色,參與植物體的生物固氮、硝酸鹽還原以及含氮化合物運(yùn)輸?shù)龋?5-27]。在豆科植物和非豆科植物中,施鉬可提高大豆、水稻和大麥的硝酸還原酶活性,促進(jìn)氮代謝,降低植株硝酸鹽含量,進(jìn)而提高氮肥利用率[28-30]。Elrys 等[31]研究表明,施用鉬濃度100 mg/L 時(shí)馬鈴薯塊莖中硝酸鹽含量顯著降低??梢?jiàn),目前有關(guān)鉬對(duì)烤煙和植物生長(zhǎng)和品質(zhì)影響的研究已有報(bào)道,但鉬對(duì)白肋煙苗期生物量積累和碳氮代謝影響的研究卻鮮有涉及。為此,設(shè)置了不同鉬酸鈉濃度噴施試驗(yàn),旨在明確鉬酸鈉對(duì)白肋煙色素含量、光合作用、氮素還原同化作用、硝酸鹽含量和碳氮化合物協(xié)調(diào)性的影響,并篩選出白肋煙苗期鉬酸鈉的適宜施用濃度,為白肋煙減害和煙葉品質(zhì)的提高提供依據(jù)。
試驗(yàn)于2017 年4 月在國(guó)家煙草生理生化研究基地人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。氣候室條件設(shè)置:溫度22~28 ℃,每12 h晝夜光暗交替(白天時(shí)間段設(shè)置為7:00—19:00),光照強(qiáng)度800 μmol·m-2·s-1,相對(duì)濕度85%。供試白肋煙品種為T(mén)N90,在人工氣候室內(nèi)采用漂浮育苗,煙草種子用2%次氯酸鈉溶液消毒2次,每次5 min,隨后將其播種在填滿(mǎn)基質(zhì)的200 孔育苗盤(pán)中。浮盤(pán)規(guī)格:長(zhǎng)78 cm,寬38 cm,高5.5 cm,每盤(pán)200孔。育苗框規(guī)格:長(zhǎng)82 cm,寬45 cm,高20 cm,每框1 個(gè)浮盤(pán),育苗時(shí)在框中加入10 L 清水,待煙苗長(zhǎng)至大十字期時(shí)開(kāi)始加入Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液[8]。待煙苗長(zhǎng)至4~5 片真葉(苗齡40 d 左右)時(shí),選取長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的壯苗,用去離子水將根系沖洗干凈后,移栽至小花盆中(規(guī)格7.1 cm×6.7 cm×7.8 cm),每盆1 株,煙苗長(zhǎng)至七葉一心時(shí)進(jìn)行噴施處理。每處理選取10 株長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的煙苗,共計(jì)50株。用清水和不同濃度鉬酸鈉溶液于每天17:00時(shí)對(duì)煙苗葉片正反面進(jìn)行噴施,至葉片上液滴均勻且欲下滴時(shí)為止,連續(xù)噴施3 d,最后1 次噴施后間隔7 d 取樣測(cè)定。
試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),設(shè)置5個(gè)處理,即處理1 為清水對(duì)照(CK);處理2 為0.1%鉬酸鈉;處理3 為0.5%鉬酸鈉;處理4 為1.0%鉬酸鈉;處理5 為2.0%鉬酸鈉。每處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。
1.3.1 樣品處理
在最后一次噴施后7 d 取樣并進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。將各處理煙苗平均分成兩份,分別用于新鮮樣品檢測(cè)和殺青樣品保存。樣品分組后,將各處理煙苗的根、莖、葉分離,用去離子水清洗干凈,并用吸水紙吸干后進(jìn)行測(cè)定和樣本保存。
新鮮樣本用于煙葉色素含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、硝酸還原酶活性(NRA)和可溶性蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))測(cè)定。殺青樣品的制作方法:將各處理樣品葉片清潔干凈后,放入烘箱中于105 ℃殺青20 min,60 ℃烘干至恒質(zhì)量,稱(chēng)量,磨碎,過(guò)0.3 mm(60目)篩,用于煙葉干物質(zhì)積累量、含量和常規(guī)化學(xué)成分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的測(cè)定。
1.3.2 煙草光合速率的測(cè)定
選取各處理長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的煙苗,采用便攜式光合測(cè)定儀(LI-6400,美國(guó)Licor 公司)測(cè)定光合速率。該儀器為開(kāi)放式氣路,紅藍(lán)光源,光照強(qiáng)度為800 μmol·m-2·s-1,測(cè)定時(shí)間為8:30—10:00,測(cè)定對(duì)象為煙苗最大功能葉(從下向上數(shù),第3 葉位)[32]。每處理重復(fù)測(cè)定3 次。
1.3.3 煙葉NRA、色素和可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
選取各處理長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的煙苗,選擇最大功能葉的6~8 支脈(位于葉尖與葉基中部)之間葉肉,用剪刀剪成2 mm × 5 mm 條狀,混勻后用于煙葉NRA、可溶性蛋白含量、色素含量的測(cè)定,每處理數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值。采用95%乙醇提取法測(cè)定色素含量,采用活體法測(cè)定NR 活性,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[14]。
1.3.4 總氮、總糖和還原糖含量的測(cè)定
采用濃H2SO4水楊酸法測(cè)定煙葉含量[33]。煙葉總氮、總糖和還原糖含量按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[34-35]用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3,德國(guó)BRAN+LUEBBE 公司)檢測(cè)。
煙葉氮素積累量和氮素利用效率的計(jì)算:
氮素積累量(mg/株)=煙葉總氮含量(%,g/100 g)×煙葉干質(zhì)量(g/株)×1 000
氮素利用效率(NUE,mg DW/mg N)=煙葉干物質(zhì)量/煙葉氮素積累量
采用Excel 2016 和Origin pro 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖;使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析,用LSD 法對(duì)煙葉干物質(zhì)積累量、色素含量、NRA、總氮和氮素積累量等指標(biāo)進(jìn)行方差分析和方差齊性檢驗(yàn)。
由圖1 可知,在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),施用鉬酸鈉后煙葉干物質(zhì)積累均呈增加趨勢(shì),且隨鉬酸鈉濃度增加煙葉干物質(zhì)積累呈升高趨勢(shì)。其中,0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后,煙葉干物質(zhì)積累量較對(duì)照分別提高7.83%、16.87%、30.72%和30.12%,其中1.0%和2.0%鉬酸鈉處理效果最佳。這說(shuō)明施用1.0%和2.0%鉬酸鈉對(duì)增加煙葉干物質(zhì)積累和培育壯苗有積極作用。
圖1 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉干物質(zhì)積累量的比較Fig.1 Comparison of dry matter accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
葉綠素是參與植物葉綠體內(nèi)光合作用的重要色素,能夠捕捉光能并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)形成均具有重要作用[36]。由圖2 可知,在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),施用不同濃度鉬酸鈉后,煙葉色素含量和光合速率均呈現(xiàn)出升高趨勢(shì);在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后煙葉色素含量較對(duì)照分別提高1.13%、2.55%、4.25%和3.40%,其中噴施1.0%鉬酸鈉后,煙葉色素含量明顯高于對(duì)照,且差異達(dá)到顯著水平;煙葉光合速率分別較對(duì)照提高0.85%、3.70%、12.81%和12.15%,其中,1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后,煙葉光合速率與對(duì)照間差異均達(dá)到顯著水平。本試驗(yàn)中,在0.1%~1.0%鉬酸鈉范圍內(nèi),煙草色素含量和光合速率均隨鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì),但在鉬酸鈉濃度大于1.0%時(shí)煙葉色素含量和光合速率相對(duì)穩(wěn)定,且保持在較高水平,即煙葉光合速率在2.0%鉬酸鈉和1.0%鉬酸鈉處理間差異不顯著。
圖2 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉光合速率和色素含量的比較Fig.2 Comparison of photosynthetic rate and pigment content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
煙葉中的總糖和還原糖是重要碳水化合物,為煙株氮代謝活動(dòng)提供能量物質(zhì)和碳骨架,對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響[8]。由圖3 可知,在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),噴施鉬酸鈉后,煙葉總糖含量變化不大,但煙葉還原糖含量與對(duì)照間差異達(dá)到顯著或極顯著水平;在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),隨著施用鉬酸鈉濃度的增加,煙葉還原糖含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì),其中在鉬酸鈉濃度為0.5%、1.0%和2.0%時(shí),煙葉還原糖含量較對(duì)照分別增加19.69%、23.38%和22.46%??梢?jiàn),噴施鉬酸鈉能夠提高煙苗碳同化能力,促進(jìn)碳水化合物合成,為煙草中還原同化和其他代謝過(guò)程提供充足碳源,這有利于降低煙葉硝酸鹽含量和提高煙葉產(chǎn)量[8]。
圖3 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉總糖和還原糖含量的比較Fig.3 Comparison of total sugar and reducing sugar contents among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
NR 是植物體硝酸鹽代謝途徑中的限速酶,具有將硝酸鹽還原成為亞硝酸鹽的作用[32]。鉬是NR 的重要組分,增施鉬肥能夠提高作物NRA,對(duì)促進(jìn)煙株的同化利用有積極作用,對(duì)降低煙株體內(nèi)硝酸鹽含量和提高氮肥利用效率均有良好效果[10]。由圖4 可知,煙葉NRA 隨著鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)。其中,施用鉬酸鈉濃度為0.5%、1.0%和2.0%時(shí),煙葉NRA較對(duì)照分別提高16.87%、30.72%和30.12%,差異均達(dá)到極顯著水平。施用2.0%鉬酸鈉后,煙葉NRA 與鉬酸鈉濃度為1.0%時(shí)差異不大,說(shuō)明鉬酸鈉能促進(jìn)苗期白肋煙NRA 的提高,且濃度為1.0%時(shí)效果最佳。
圖4 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉硝酸還原酶活性的比較Fig.4 Comparison of nitrate reductase activity among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
葉片中可溶性蛋白不僅參與了植物器官的建成,而且很大一部分蛋白是具有調(diào)控生理生化反應(yīng)活性的酶類(lèi)物質(zhì),其含量可以反映植物的代謝強(qiáng)度[37]。由圖5 可知,在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),隨著鉬酸鈉濃度的增加,煙葉可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì),說(shuō)明施用鉬酸鈉能促進(jìn)氮素同化作用,有利于煙葉可溶性蛋白的形成。其中,在鉬酸鈉為1.0%和2.0%時(shí),煙葉可溶性蛋白含量較對(duì)照分別提高18.43%和17.84%,差異達(dá)到極顯著水平,且鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí),煙葉可溶性蛋白含量差異不大。由此可見(jiàn),在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),1.0%鉬酸鈉濃度對(duì)提高煙葉可溶性蛋白含量的作用效果最佳。
圖5 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉可溶性蛋白含量的比較Fig.5 Comparison of soluble protein content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
由圖6 可知,在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),煙葉總氮含量隨鉬酸鈉濃度的增加呈現(xiàn)出下降趨勢(shì),其中在鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí),煙葉總氮含量較對(duì)照分別降低10.76%和10.57%,差異達(dá)到顯著水平。在0.1%~2.0%濃度范圍內(nèi),煙葉氮素積累量隨鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì),其中在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理時(shí),煙葉氮素積累量較對(duì)照分別提高3.50%、7.44%、16.59%和16.37%。噴施1.0%鉬酸鈉的煙葉總氮含量下降10.76%,煙葉氮素積累量提高16.59%,說(shuō)明噴施鉬酸鈉能增加煙葉干物質(zhì)積累量,從而使煙葉氮素積累量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。原因可能是由于鉬酸鈉處理能促進(jìn)煙草干物質(zhì)積累,從而對(duì)總氮含量產(chǎn)生稀釋效應(yīng),最終導(dǎo)致煙葉總氮含量下降。另一方面也表明,噴施鉬酸鈉能促進(jìn)煙株的碳氮代謝,對(duì)增加煙葉干物質(zhì)積累量和降低硝酸鹽含量有積極作用。
圖6 不同鉬酸鈉濃度處理煙葉總氮含量和氮素積累量的比較Fig.6 Comparison of total nitrogen content and nitrogen accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
圖7 鉬酸鈉處理煙葉和的比較Fig.7 Comparison of content and content/total nitrogen content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
由圖8 可知,噴施不同濃度鉬酸鈉均能提高煙葉氮素利用效率,且差異達(dá)到顯著或極顯著水平。與對(duì)照相比,鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí),煙葉氮素利用效率分別提高12.42%和10.92%,與鉬酸鈉能促進(jìn)煙葉干物質(zhì)積累,提高煙草氮代謝能力有關(guān)。
圖8 鉬酸鈉處理煙葉氮素利用效率的比較Fig.8 Comparison of nitrogen use efficiency among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations
NR 是高等植物氮同化過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶,可直接調(diào)節(jié)硝酸鹽的還原,從而調(diào)節(jié)氮代謝,并影響光合碳代謝[38]。Mo 作為NR 的主要組成成分,參與植物的氮代謝和碳代謝過(guò)程[39]。本試驗(yàn)條件下,噴施不同濃度鉬酸鈉能不同程度地提高煙葉色素含量和光合速率,與劉利[40]和張紀(jì)利等[41]在草莓和烤煙上的研究結(jié)果一致。其中在鉬酸鈉濃度為1.0%時(shí),煙葉還原糖含量和干物質(zhì)積累量顯著提高,與色素和光合作用指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果一致,而總糖含量與對(duì)照間差異不大,與崔國(guó)明等[12]和張紀(jì)利等[41]的研究結(jié)果有所不同,可能是因?yàn)殂f酸鈉處理對(duì)煙葉總糖和還原糖含量的影響有時(shí)間效應(yīng),煙草生長(zhǎng)前期鉬酸鈉處理能促進(jìn)光合作用直接產(chǎn)物(葡萄糖、果糖等還原性糖)的生成,而對(duì)總糖(淀粉等)的影響相對(duì)滯后。這說(shuō)明鉬酸鈉處理能夠提高煙草光合作用能力,促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累,可能與鉬能提高作物葉綠素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)[42],而鉬酸鈉參與植物體光合作用的機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。此外,噴施不同濃度鉬酸鈉均能提高煙葉NRA 和可溶性蛋白質(zhì)含量,其中鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí),煙葉硝酸鹽含量顯著降低,NRA 顯著提高,同時(shí),在該處理?xiàng)l件下煙草可溶性蛋白質(zhì)含量顯著提高,表明該處理?xiàng)l件下有更多的被吸收利用。鉬酸鈉可以通過(guò)提高NR 活性,增強(qiáng)氮素還原同化能力,從而降低煙葉硝酸鹽積累量,與趙靜等[21]、崔國(guó)明等[12]研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果中,噴施不同濃度鉬酸鈉能提高煙葉氮素積累量和煙葉干物質(zhì)積累量,可能是由于鉬酸鈉提高氮同化能力,進(jìn)而增強(qiáng)碳同化能力,促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累和植株的生長(zhǎng),其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探索。值得關(guān)注的是,白肋煙需氮量高,氮利用效率低,而鉬酸鈉的施用能提高煙葉氮素利用效率,進(jìn)而減少氮肥施用,對(duì)優(yōu)質(zhì)低危害煙葉的生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗(yàn)中,鉬酸鈉濃度為1.0%時(shí)對(duì)苗期白肋煙煙葉總體效果較好,最佳劑量能否作為田間的最佳施用量,有待進(jìn)一步大田試驗(yàn)驗(yàn)證。
在溫度22~28 ℃,光照強(qiáng)度800 μmol·m-2·s-1,相對(duì)濕度85%,每12 h 晝夜光照交替的人工氣候室條件下,白肋煙煙苗施用0.1%~2.0%濃度鉬酸鈉后,煙葉色素含量、光合速率、兩糖含量、NRA 和可溶性蛋白含量、煙葉干物質(zhì)積累量均增加,煙葉氮素利用效率明顯提高,且硝酸鹽含量顯著降低。鉬酸鈉處理能提高白肋煙煙葉氮素還原同化能力和碳同化能力,促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累,從而促進(jìn)硝酸鹽還原同化過(guò)程,有利于降低煙葉硝酸鹽含量,在白肋煙苗期以1.0%鉬酸鈉處理效果最佳。