黃瑞環(huán)，芶劍渝，韓小斌，劉 京，彭玉龍，王 丹，張明岳，張成省，趙棟霖*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11 號(hào) 266101

2. 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州省遵義市紅花崗區(qū)延安路143 號(hào) 563000

3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東省青島市城陽(yáng)區(qū)長(zhǎng)城路700 號(hào) 266109

煙草赤星病、黑脛病和青枯病是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害。赤星病為典型流行病，具有間歇性和爆發(fā)性的特點(diǎn)［1］；黑脛病可危害烤煙、晾煙、曬煙、香料煙、白肋煙等栽培煙草［2］；而青枯病是典型的土傳細(xì)菌性病害，在我國(guó)主產(chǎn)煙區(qū)普遍發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。同時(shí)，煙田雜草與煙株?duì)幏?、?zhēng)水、爭(zhēng)光，還是許多病蟲(chóng)害的媒介和寄主，誘發(fā)病蟲(chóng)害的發(fā)生和蔓延［4-5］。目前，煙草病害和煙田雜草的防治主要依賴化學(xué)藥劑，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及病原菌產(chǎn)生抗藥性［6-7］等問(wèn)題日益突出。生物防治對(duì)環(huán)境友好，被認(rèn)為是替代化學(xué)藥劑的理想途徑。木霉屬真菌是重要的生防菌，廣泛應(yīng)用于植物病害的防治中，對(duì)煙草病害的防治也有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉在培養(yǎng)皿上可吞沒(méi)煙草黑脛病菌，對(duì)煙草黑脛病菌0號(hào)生理小種具有較強(qiáng)的抗性［8］；彭閣等［9］通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出菌株里氏木霉ZP2-1 和擬康寧木霉ZP2-3，對(duì)煙草黑脛病菌具有較好的抑制效果；王革等［10］利用誘捕法從土壤中篩選出了1 株木霉菌株（Tv-1）對(duì)赤星病菌具有極強(qiáng)的拮抗作用。同時(shí)木霉在防除田間除草上也有報(bào)道，Javaid A 等［11］用4 種木霉的發(fā)酵液對(duì)小麥田的兩種雜草進(jìn)行了除草活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4 種木霉的代謝物可顯著降低兩種目標(biāo)雜草根和莖生長(zhǎng)參數(shù)；朱海霞等［12］研究表明，菌株HZ-31 多孢木霉的可濕性粉劑對(duì)豬殃殃和藜兩種闊葉雜草的盆栽除草效果顯著高于純發(fā)酵液。隨著陸地微生物菌株篩選研究的深入，研究者們把尋找農(nóng)藥的目光投向了海洋。海洋木霉生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特，代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，且具有特殊的生物活性，是有待開(kāi)發(fā)的新型生防微生物資源。目前海洋木霉在防治稻瘟病、棉花黃萎病、小麥赤霉病上已有研究［13-14］，但海洋來(lái)源木霉及其代謝產(chǎn)物用于防治煙草病害和煙田雜草上還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，以來(lái)源于海南紅樹(shù)林的海洋木霉為研究對(duì)象，以煙草黑脛病菌、赤星病菌、青枯病菌及煙田雜草反枝莧（Amaranthus retroflexus）為靶標(biāo)進(jìn)行了生防菌株的篩選，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)海洋微生物用于煙草有害生物的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

海洋木霉分離自海南紅樹(shù)（根、莖、葉）和紅樹(shù)林海泥。

1.1.2 病原菌

供試病原菌為煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、煙草赤星病菌［Alternaria alternate（Fries）Keissler］、煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum），均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）海洋真菌分離純化培養(yǎng)基：3%海鹽馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；（2）病原菌培養(yǎng)基：黑脛病菌用燕麥（OA）培養(yǎng)基培養(yǎng)，赤星病菌用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，青枯病菌采用營(yíng)養(yǎng)肉湯（NA）培養(yǎng)基。海洋真菌和病原菌于-80 °C 保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海洋木霉的分離

紅樹(shù)（根、莖、葉）樣品采用平板稀釋法［15］和組織分離法［16］進(jìn)行海洋真菌的分離，海泥樣品采用平板稀釋法進(jìn)行海洋真菌的分離。海洋木霉用3%海鹽PDA 培養(yǎng)基分離，放入28 ℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3～7 d，根據(jù)菌落顏色、菌絲長(zhǎng)短等形態(tài)特征挑取木霉菌絲于PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)2～3次進(jìn)行純化，并歸類、編號(hào)，于-80 ℃超低溫保存。

1.2.2 海洋木霉的鑒定

海洋木霉的DNA 提取方法參考文獻(xiàn)［17］。PCR 擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1 和ITS4［18］，獲得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列通過(guò)Blast 程序在GenBank 上進(jìn)行比對(duì)，選取同源性較高ITS 基因序列進(jìn)行同源性比較，并采用MEGA7.0 中的Neighbour-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定海洋真菌的種屬。

1.2.3 活性海洋木霉的篩選

將分離的海洋木霉和3 種煙草病原菌（煙草黑脛病菌、赤星病菌和青枯病菌）采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法［19］進(jìn)行活性篩選，設(shè)置空白對(duì)照。每處理3 次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后觀察抑制效果。海洋木霉對(duì)青枯病菌采用十字交叉法測(cè)量其抑菌圈直徑，對(duì)黑脛病菌和赤星病菌計(jì)算抑制率。計(jì)算公式：

抑菌率=［（病原菌對(duì)照菌落半徑-病原菌指向海洋真菌的半徑）/病原菌對(duì)照菌落半徑］×100%

（1）

1.2.4 除草活性

將反枝莧種植于邊長(zhǎng)10 cm 的正方形塑料盒中，每盒20 粒，在人工氣候箱中（28 °C，12 h 光照，12 h 黑暗）培養(yǎng)1 周。海洋真菌采用PDW 培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)9 d 后，其發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取兩次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃和90 r/min 的條件下濃縮蒸干。海洋真菌發(fā)酵提取物用4%甲醇-無(wú)菌水溶解，并加入0.2%農(nóng)乳1602（三苯乙烯基苯酚聚氧丙烯聚氧乙烯醚）助溶，配制成10.0 mg/mL 的溶液，噴霧于葉片和莖上，每盆噴霧量3 mL。以等量無(wú)菌水溶液和草甘膦為對(duì)照，置于28 ℃人工氣候箱中，12 h 光照，12 h 黑暗，7 d 后觀察除草效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 和MEGA7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析和作圖。用SPSS Statistics 19 軟件、Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋木霉分離鑒定及多樣性分析

從海南紅樹(shù)根、莖、葉和海泥樣品中共分離得到25 株海洋木霉。其中從紅樹(shù)根中分離得到11株，占總數(shù)的44%；海泥中分離得到10 株，占總數(shù)的40%；莖中得到4 株，占總數(shù)的16%；紅樹(shù)的葉中沒(méi)有分離得到木霉，見(jiàn)圖1。

通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將所測(cè)序列在美國(guó)生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast 進(jìn)行相似性搜索，發(fā)現(xiàn)所得木霉和與其序列最為接近的木霉相似度均在99%～100%之間，由此確定菌株種屬范疇。將測(cè)序后獲得的ITS序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取其登錄號(hào)。

圖1 不同樣品分離的木霉數(shù)量比較Fig.1 Amounts of Trichoderma sp. isolated from different samples

根據(jù)這25 株木霉的ITS-rDNA 序列及Blast 比對(duì)結(jié)果，利用MEGA 7.0 軟件，分析堿基組成并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出，25 株海洋木霉屬于5 個(gè)種。HJ5、HJ7 等17 株木霉為棘孢木霉（Trichoderma asperellum），HT8 和HT10 為鉤狀木霉（Trichoderma hamatum），HT11 為擬康寧木霉（Trichoderma koningiopsis），HT6、HT7為 里 氏 木 霉（Trichoderma reesei），HT4、HT12 和1HT 為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。25 株海洋木霉中，棘孢木霉占68%，哈茨木霉占12%，鉤狀木霉和里氏木霉分別占8%，擬康寧木霉占4%。

2.2 海洋木霉對(duì)煙草病害的拮抗效果

通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)，測(cè)定了25 株木霉對(duì)煙草黑脛病菌、赤星病菌和青枯病菌的抑制作用，對(duì)黑脛病菌和赤星病菌的抑制率分別達(dá)60%和40%。多數(shù)海洋木霉對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌具有明顯的拮抗作用（表1），只有HT6 和HT7 兩株木霉對(duì)青枯病菌有抑制作用（圖3）。從表1 中可以看出，23 株海洋木霉對(duì)煙草黑脛病菌的抑制率達(dá)到30%以上，HT2、HT6、HT8、HT11、HJ3、5HJ、HJ7、HG2、HG9、9HG、HG11、HG14 和HG16 共13 株海洋木霉的抑制率達(dá)到60%以上，其中以5HJ 的抑制效果最好，抑制率為84.1%。HT11、HG11、HT3、HG16 和HG9 等5 株木霉對(duì)煙草赤星病菌的抑制效果較好，分別達(dá)到40.3%、42.9%、43.7%、44.5%和47.9%。5HJ、G9、HG16 和HT11 等對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌均具有較好的抑菌效果。

2.3 海洋木霉對(duì)反枝莧的抑制效果

從圖4 和表2 中可以看出，多數(shù)海洋木霉提取物對(duì)雜草反枝莧的除草效果不明顯，僅有HT10 和1HT 兩株木霉的提取物對(duì)反枝莧的生長(zhǎng)有抑制作用。HT10 的除草活性較高，經(jīng)其發(fā)酵提取物處理后的反枝莧葉片出現(xiàn)枯萎、生長(zhǎng)不正常、葉片發(fā)黃；1HT 處理的反枝莧部分葉片呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，部分嫩葉出現(xiàn)枯萎，葉片發(fā)黃。由于HT10 除草效果更為明顯，因此可考慮從HT10 發(fā)酵提取物中尋找具有除草活性的先導(dǎo)化合物。

圖2 海洋木霉與參考分類群間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree between marine-derived Trichoderma sp. and reference taxa

表1 木霉對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌的抑制率①Tab.1 Inhibition rates of Trichoderma sp. against Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker and Alternaria alternata（Fries）Keissler （%）

圖3 5HJ、HG9、HT6 和HT7 平板對(duì)峙抑菌效果Fig.3 Antibacterial effects of 5HJ, HG9, HT6 and HT7 plates

圖4 HT10 和1HT 對(duì)反枝莧的除草效果Fig.4 Herbicidal effects of HT10 and 1HT against A. retroflexus L.

表2 木霉對(duì)反枝莧的抑制效果①Tab.2 Inhibition effects of Trichoderma sp. against Amaranthus retroflexus L.

3 結(jié)論

從海南紅樹(shù)和海泥中分離得到25 株海洋真菌，鑒定為5 種木霉。其中棘孢木霉（T. asperellum）為優(yōu)勢(shì)種。海洋木霉及其提取物對(duì)煙草黑脛病菌（P. parasitica var. nicotianae）、赤星病菌［A. alternate（Fries）Keissler］和青枯病菌（R. solanacearum）3種病原菌均有抑制效果。其中，3 株棘孢木霉5HJ、HG9、HG16 和1 株擬康寧木霉HT1 對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌有較好的抑制效果；1 株鉤狀木霉HT10 和1 株哈茨木霉1HT 具有潛在除草活性?？梢?jiàn)，海洋木霉多個(gè)屬種表現(xiàn)出了抗菌除草活性，具有開(kāi)發(fā)成為新型生物農(nóng)藥的潛力。