方敏敏 王翠麗

摘要?為了明確17α，20β雙羥孕酮（DHP）及其核受體調(diào)控促性腺激素釋放激素mRNA在雄性斑馬魚(yú)腦組織中的表達(dá)機(jī)制，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、類(lèi)固醇激素活體和離體暴露方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，野生型雄性斑馬魚(yú)活體暴露于100 nmol/L DHP水溶液，伴隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，gnrh2和gnrh3 mRNA表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)，24 h出現(xiàn)表達(dá)最高峰;野生型雄性斑馬魚(yú)活體分別暴露于10和100 nmol/L DHP水溶液24 h。與對(duì)照組相比，100 nmol/L DHP試驗(yàn)組gnrh2和gnrh3 mRNA表達(dá)量升高，差異顯著（P<0.05），而10 nmol/L DHP試驗(yàn)組無(wú)顯著變化（P>0.05）;野生型雄性斑馬魚(yú)活體暴露于100 nmol/L DHP與100 nmol/L RU486混合水溶液24 h，試驗(yàn)組gnrh2和gnrh3 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化（P>0.05）;野生型和孕酮核受體敲除型（pgr-/-）雄性斑馬魚(yú)活體分別暴露于100 nmol/L DHP水溶液24 h，與野生型試驗(yàn)組相比pgr-/-型試驗(yàn)組gnrh2和gnrh3 mRNA表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;野生型和pgr-/-型雄性斑馬魚(yú)腦組織離體暴露于含100 nmol/L DHP的L-15培養(yǎng)液24 h，與野生型試驗(yàn)組相比pgr-/-型試驗(yàn)組gnrh2和gnrh3 mRNA表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。由此可見(jiàn)，DHP與核受體結(jié)合可直接調(diào)控雄性斑馬魚(yú)腦組織中促性腺激素釋放激素gnrh2和gnrh3 mRNA表達(dá)。

關(guān)鍵詞?斑馬魚(yú);17α，20β雙羥孕酮;孕酮核受體;促性腺激素釋放激素

中圖分類(lèi)號(hào)?S?917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0099-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.029

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

mRNA Expression of Gonadotropin?releasing Hormone in Zebrafish Induced by DHP and Its Nuclear Receptor

FANG Min?min1，2， WANG Cui?li1，2

（1.Institute of Geography and Oceanography， Nanning Normal University， Nanning，Guangxi530000;2. Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf， Nanning Normal University， Nanning，Guangxi530000）

Abstract?In order to clarify that 17α，20β dihydroxyproterone （DHP） and its nuclear receptorregulated expression mechanism of gonadotropin?releasing hormone （GnRH） mRNA in male zebrafish，real?time PCR， steroid hormone exposure in vivo and in vitro were used in this test. The results showed that it took 24 h for gnrh2 and 24 h for gnrh3 to respond significantly （P<0.05）. 24 h 100 nmol/LDHP exposure significantly increased the expression of gnrh2 and gnrh3 mRNA （P<0.05）.

With and without DHP in vivo treatment， compared with wild type zebrafish treatment group， mRNA expressions of gnrh2 and gnrh3 were significantly decreased in pgr-/- zebrafish treatment group （P < 0.05）， while that in wild?type zebrafish and pgr-/- zebrafish brain tissue were all exposed to L?15 culture medium containing 100 nmol/L DHP for 24 h， compared with wild?type zebrafish treatment group， mRNA expressions of gnrh2 and gnrh3 were significantly decreased in pgr-/- zebrafish treatment group （P < 0.05）. DHP and its nuclear receptors could regulate mRNA expressions of gonadotropin?releasing hormone in male zebrafish.

Key words?Zebrafish;17α，20β?dihydroxy?4?pregnen?3?one;Nuclear progesterone receptor;Gonadotropin?releasing hormone

17α，20β雙羥孕酮（DHP）是魚(yú)類(lèi)精巢所特有的調(diào)控生殖系統(tǒng)的暫時(shí)性孕激素[1]，在雄魚(yú)精原細(xì)胞增殖分化期，血清中DHP的水平會(huì)出現(xiàn)一個(gè)短暫和顯著的升高過(guò)程[2-3]，這不僅對(duì)誘導(dǎo)B型精原細(xì)胞分化為初級(jí)精母細(xì)胞起決定作用[4]，而且對(duì)精子成熟、排精并獲能也起到重要的作用[5-6]。Wang等[7]研究表明DHP、孕酮核受體和促性腺激素釋放激素（gonadotropin?releasing hormone，GnRH）共同參與調(diào)控促性腺激素（gonadotropins hormone，GTH）mRNA表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控雄魚(yú)生殖周期。

哺乳動(dòng)物下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素可通過(guò)脈沖形式進(jìn)入垂體門(mén)脈系統(tǒng)，并與垂體中的受體結(jié)合促使垂體產(chǎn)生促性腺激素并對(duì)生殖起到重要的調(diào)控作用[8-12]。魚(yú)類(lèi)的相關(guān)研究已表明，魚(yú)類(lèi)雖缺少垂體門(mén)脈系統(tǒng)，但腦組織中促性腺激素釋放激素在調(diào)控垂體促性腺激素產(chǎn)生、性腺組織發(fā)育和性成熟中仍起至關(guān)重要的作用[13]。筆者以雄性斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，研究雄性斑馬魚(yú)在DHP及其核受體的調(diào)控作用下下丘腦組織中促性腺激素釋放激素2（gonadotropin?releasing hormone 2，GnRH2）和促性腺激素釋放激素3（gonadotropin?releasing hormone 3，GnRH3）mRNA表達(dá)的變化規(guī)律，探索其在腦組織中的信號(hào)調(diào)控通路，以期豐富DHP及其核受體在雄魚(yú)生殖內(nèi)分泌中的作用機(jī)理。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗(yàn)動(dòng)物。

共用72尾野生型（WT）圖賓根家系（Tüebingen）成年（3～4月齡）雄性斑馬魚(yú)、6尾孕酮核受體敲除型（pgr-/-）成年（3～4月齡）雄性斑馬魚(yú)，孕酮核受體基因敲除方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件如下：室內(nèi)恒溫28 ℃;光照14 h（08：00—22：00），非光照10 h（22：00—次日08：00）;水體為紫外滅菌處理的去離子循環(huán)水，pH 7.2～7.6;成年斑馬魚(yú)每天早上（08：30—09：00）、中午（12：00—12：30）和傍晚（18：30—19：00）各投喂熱帶魚(yú)食3次，飼養(yǎng)條件詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。

1.1.2?藥品。

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）、17α，20β雙羥孕酮（DHP）、米服司酮（RU486）購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3?主要試劑。

RNAzol試劑，購(gòu)自MRC公司;SYBR Select Master Mix試劑盒，購(gòu)自ABI公司;QIAquick Gel Extraction 試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司;rTaq酶、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker、PMD19-T克隆載體，均購(gòu)自TaKaRa公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞、X-gal，購(gòu)自北京全式金公司;L-15粉末，購(gòu)自GIBCO公司;瓊脂糖、DEPC、Hepes、D-Hank緩沖液、青霉素、鏈霉素，均購(gòu)自Solarbio公司;引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.4?主要儀器。

電泳儀（型號(hào)為Powerpac HV 164-5056），購(gòu)自Bio-Rad公司;超微量紫外分光光度計(jì)（型號(hào)為NanoDrop-1000），購(gòu)自NanoDrop公司;全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為Syngene Genius），購(gòu)自Syngene公司;低溫恒溫槽（型號(hào)為DC-1006），購(gòu)自無(wú)錫沃信儀器有限公司;梯度熱循環(huán)儀（型號(hào)為T(mén)100），購(gòu)自Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀（型號(hào)為7500FAST），購(gòu)自ABI公司;高速離心機(jī)（型號(hào)為5810R），購(gòu)自Eppendorf公司;體視顯微鏡（型號(hào)為CX22），購(gòu)自O(shè)lympus公司;多功能顯微鏡（型號(hào)為BX51），購(gòu)自O(shè)lympus公司;離心機(jī)（型號(hào)為MiniSpin plus），購(gòu)自Eppendorf公司。

1.2?方法

1.2.1?野生型雄性斑馬魚(yú)DHP活體暴露時(shí)間效應(yīng)。

13：00隨機(jī)取30尾活體野生型雄性斑馬魚(yú)放入暴露魚(yú)缸（4 L）中，加入DHP，使水體中DHP終濃度為100 nmol/L，每次取樣6尾，暴露0、3、6、12和24 h取樣，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃下保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對(duì)表達(dá)分析。

1.2.2?野生型雄性斑馬魚(yú)DHP活體暴露劑量效應(yīng)。

13：00隨機(jī)取18尾活體野生型雄性斑馬魚(yú)放入3個(gè)暴露魚(yú)缸（4 L）中，加入DHP，使水體中DHP終濃度分別為0、10和100 nmol/L，連續(xù)暴露24 h后，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃下保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對(duì)表達(dá)分析。

1.2.3?野生型雄性斑馬魚(yú)活體DHP和RU486暴露。

13：00隨機(jī)取12尾活體野生型雄性斑馬魚(yú)放入2個(gè)暴露魚(yú)缸（4 L）中，加入DHP和RU486，使水體中類(lèi)固醇終濃度分別為0 nmol/L（DHP）+0 nmol/L（RU486）、100 nmol/L（DHP）+100 nmol/L（RU486），連續(xù)暴露24 h，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃下保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對(duì)表達(dá)分析。

1.2.4?野生型和孕酮核受體敲除型雄性斑馬魚(yú)DHP活體暴露。

13：00隨機(jī)取6尾活體野生型和6尾活體孕酮核受體敲除型（pgr-/-）雄性斑馬魚(yú)放入2個(gè)暴露魚(yú)缸（4 L）中，分別加入DHP，使水體中DHP終濃度為100 nmol/L，連續(xù)暴露24 h，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對(duì)表達(dá)分析。

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